髓鞘化小鼠轴突中神经丝运输的荧光光激活成像

摘要

来源： Boyer, N. P. et. al., 小鼠离体胫神经中神经丝运输的成像与分析。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了利用荧光光激活方法分析周围神经有髓轴突中神经丝运输的技术。通过追踪经光激活的绿色荧光标记神经丝，该技术可为神经退行性疾病中的轴突运输提供研究依据。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 神经生理盐水溶液的配制

1. 配制 100 mL Breuer 氏生理盐水：98 mM 氯化钠（NaCl）、1 mM 氯化钾（KCl）、2 mM 磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、1 mM 硫酸镁（MgSO₄）、1.5 mM 氯化钙（CaCl₂）、5.6% D-葡萄糖、23.8 mM 碳酸氢钠（NaHCO₃），溶于双蒸水中。
2. 使用前，将 95% 氧气/5% 二氧化碳（碳合气）通入生理盐水溶液中至少 30 分钟。剩余的生理盐水可在一周内重复使用，但每次使用前必须重新充氧。
3. 将充氧后的生理盐水倒入 60 mL 注射器中，并确保注射器内残留空气最少。

2. 神经灌流室的初始组装

1. 如图1A所示，连接注射器和管路，并将出流管放入废液瓶中。
2. 将外密封垫放入灌流室外壳中，确保流体入口和出口柱与密封垫上的孔对齐。
3. 将内密封垫（硅胶，100 µm 厚）平铺在 #1.5 圆形盖玻片（直径 40 mm）上，小心抚平密封垫上的任何褶皱，以确保密封紧密。为便于后续组装，将盖玻片和密封垫放置在纸巾或擦拭布上，密封垫面朝上。

3. 小鼠胫神经的解剖与制备

1. 采用二氧化碳吸入法或其他机构批准的方法处死动物。当动物停止活动/呼吸时开始计时，因为实验必须在处死后的3小时内完成。
2. 用70%乙醇喷洒动物毛发，并使用电动剃刀尽可能去除腿部和背部的毛发。
3. 使用一把较大的解剖剪，在脊柱中段附近的背部皮肤做一纵向切口，并继续沿动物腹侧延伸切口。从此切口开始，通过轻轻将皮肤从肌肉上拉开并剪断筋膜，逐步剥离四肢的皮肤。
4. 将动物仰卧放置于解剖托盘上，并用大头针固定四肢。可选择性地固定尾巴以进一步减少移动。
5. 使用显微解剖剪，在尾部与膝盖之间的大腿肌肉中部做切口，以暴露坐骨神经。确保可见于肌肉中的神经未被剪断。
6. 向背侧和腹侧延伸切口以去除肌肉组织。同样地去除小腿肌肉，切割时保持浅而短，避免损伤神经。
7. 去除肌肉直至胫神经完全暴露，从其在膝盖处分出坐骨神经的位置延伸至足跟（图2A）。
   注意：在所有步骤中，包括及之后的胫神经解剖过程，应避免不必要的环境光暴露，以最大限度减少神经中光激活绿色荧光蛋白（paGFP）可能发生的意外激活。
8. 用一对镊子夹住靠近脊柱端的胫神经近端，使用显微解剖剪切断神经。操作时注意不要对神经施加张力，将其从肌肉上轻轻提起，并剪断任何连接组织。
9. 切断胫神经远离脊柱的一端（远端），并将神经转移至盛有室温含氧生理盐水的小培养皿中。从此步骤开始，务必始终明确区分并记录神经的近端和远端。
   注意：一种可行的方法是在神经远端做一斜切标记，使锥形末端清晰可见，以便识别。
10. 从神经近端开始，用一对极细尖的镊子轻轻夹住暴露的轴突末端。
11. 用另一对镊子在近端夹住神经鞘，并缓慢向神经远端拉动。神经鞘将沿轴突平滑滑动，阻力极小。确保在此过程中不对神经施加过度张力。

4. 神经灌注腔室的最终组装

1. 用手夹住神经近端，将其从生理盐水中取出，并缓慢放置于灌流室盖玻片上的内垫圈矩形开口处，放置时保持神经轻微张力，使其保持平直状态。
2. 将微通道载玻片有凹槽的一面朝向神经，并使流动方向与神经平行，覆盖在神经上。翻转盖玻片与微通道载玻片的组合体，将其放入灌流室外壳中，使微通道载玻片紧贴外垫圈。此时神经及周围的内垫圈被夹在盖玻片与微通道载玻片之间，二者由垫圈隔开，盖玻片朝上（图1B）。
3. 将灌流室放入金属外壳中，并旋转锁紧环以固定。确保塑料外壳完全置于所有金属卡夹下方，并充分拧紧以防止生理盐水泄漏。过度拧紧可能导致微通道载玻片或盖玻片破裂。将灌流室翻转，使盖玻片朝下。
4. 缓慢按压生理盐水注射器活塞，以填充灌流室。在安装和成像过程中，始终使进液管、出液管、出液瓶和注射器的位置高于灌流室本身。这可以避免虹吸现象，防止因灌流室内负压而引入气泡或导致焦距不稳定。
5. 将灌流组件转移至倒置显微镜载物台上，并将生理盐水注射器安装到注射泵中。启动电机，调节至适当速度，使流速达到0.25 mL/min。然后连接并开启设定为37 °C的管路溶液加热器。
6. 连接物镜加热器并设定为37 °C，向物镜上加油，然后将灌流室插入载物台固定装置中。
7. 在灌流室加热垫上涂抹油后，将其附着于灌流室。连接并开启灌流室加热器，设定为37 °C。
   注意：温度变化可能导致溶液脱气而在灌流室中形成气泡。若出现气泡，可短暂将溶液流速提高5-10倍，直至气泡排出灌流室。
8. 将灌流室锁定在载物台适配器上，并使物镜油与灌流室底部的盖玻片接触。
   注意：此处使用的Bioptechs灌流室与ASI载物台适配器专为倒置显微镜配置设计。

5. 荧光激活与图像采集

1. 使用明场照明，聚焦于神经底面最靠近盖玻片表面的轴突层（图2B）。有髓轴突（成年小鼠中直径通常为1–6 µm）可通过髓鞘的存在来识别，该结构在未增强对比度的明场透射光照明下可见。施万细胞切迹（Schmidt-Lanterman切迹）和郎飞结也清晰可辨。无髓轴突更细（直径通常<1 µm），通常以束状（Remak束）存在，且彼此紧密相邻，一般难以分辨。
2. 若显微镜配备自动对焦系统，请启动该系统，以在延时成像过程中维持聚焦。
3. 获取一幅明场参考图像。记录神经的方向（近脊端和远端）相对于图像的位置。
4. 使用488 nm激光和适用于paGFP的发射滤光片（例如525/50 nm）获取共聚焦图像，以记录光漂白前的自发荧光。保持低激光功率以最小化光漂白，相应调整曝光时间以检测微弱信号。例如，代表性数据在5%激光功率和4秒曝光条件下获取。记录所有后续实验中需使用的采集参数。
   注意：光激活后，理想的成像参数应使信噪比>8，并在20幅图像采集过程中光漂白程度低于原始信号的25%。轴突也可通过宽场落射荧光显微镜成像（如我们最初所做），但由于缺乏共焦性，图像质量较差。
5. 将激光功率设置为正常成像功率的约5倍，以3–4分钟的曝光时间获取一幅图像。尽管此步骤非必需，但建议执行此操作，以漂白自发荧光和其他不需要的荧光来源，从而降低背景信号，进而最大化光激活荧光的信噪比。
6. 使用步骤5.4中的设置获取一幅图像，以记录此漂白步骤后的光激活前自发荧光。
7. 在明场图像上，沿轴突方向绘制一条直线，其长度等于所需的激活窗口大小。该窗口长度将根据实验目标和参数而变化，但典型长度为：脉冲逃逸范式5 μm，脉冲扩散范式40 μm。
8. 以该直线为引导，垂直于轴突方向在视野内绘制一个矩形感兴趣区域（ROI）。该区域必须包含所有待光激活的轴突。
9. 确定使用405 nm光照进行光激活的最佳设置。
   注意：仅在首次实验性激活前执行此步骤及其子步骤。在实验过程中，必须使用相同的光激活参数。
   1. 使用405 nm激光线、低激光功率（例如5%）和像素驻留时间（例如40 µs），重复激活感兴趣区域，每次激活后获取一幅激活的绿色荧光蛋白或GFP荧光图像。重复此过程直至荧光不再增加，然后量化每幅图像中感兴趣区域的荧光强度。
   2. 绘制平均荧光强度与脉冲次数的关系图。选择荧光不再增加时的脉冲次数作为激活的最佳脉冲数。
10. 通过405 nm光的模式化激发，激活步骤5.8中绘制区域内的paGFP荧光。确保在激活前后立即各获取一幅图像。
    注意：理想的paGFP激活应在感兴趣区域（ROI）内产生边界清晰、荧光明确的区域。
11. 激活完成后启动1分钟计时器。1分钟后，开始延时序列的采集。
    注意：1分钟延迟是必要的，以允许paGFP光激活后观察到的荧光增强。对于脉冲扩散法，以30秒间隔进行5–10分钟的采集，足以测量中心及侧翼窗口初始斜率，从而测定速度和方向性。对于脉冲逃逸法，以5或10分钟间隔进行30–150分钟的采集，可分析丝状结构的长期暂停行为。
12. 保存所有采集的图像以及用于荧光激活的感兴趣区域（ROI）。
13. 移动至神经的另一区域，重复步骤5.1–5.11。若新区域位于同一轴突上，则必须距离先前激活区域至少500 µm，以避免检测到从其他激活区域移出的荧光神经丝。最终延时序列的采集必须在3小时时间窗结束前完成。
    注意：标本活性可能超过3小时，但我们尚未证实。通过熟练的解剖和制备，可在该3小时时间窗内获取五至八组10分钟的延时图像集。
14. 获取最终延时图像序列后，停止灌注生理盐水，断开溶液和腔室加热器，并将灌注装置从显微镜载物台上移除。

结果

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 x 22 矩形垫片 0.1 mm	Bioptechs	1907-1422-100	内垫圈
2-脱氧-D-葡萄糖	Sigma	D6134
带孔30毫米圆形垫圈	Bioptechs	1907-08-750	外垫圈
35 x 10 mm 培养皿	Thermo Fisher	153066	解剖皿
40 mm 圆形盖玻片	Bioptechs	40-1313-0319
60 mL 注射器 - 鲁尔锁接头尖端	BD	309653
Andor Revolution WD 转盘共聚焦系统	Andor		配备 Perfect Focus 和 FRAPPA 系统
氯化钙	费希尔	C79
盖玻片	费希尔	12-541-B	荧光素载玻片
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
解剖针	精细科学工具	26001-70
解剖镊子	精细科学工具	11251-30	精细尖头镊子
解剖显微镜	蔡司	47 50 03
带蜡的解剖盘	Ginsberg Scientific	568859
解剖剪	精细科学工具	14061-09	初始解剖剪刀
FCS2 灌流室	Bioptechs	60319-02-03
荧光素钠	Fluka	46960
内置溶液加热器	Warner Instruments	SH27-B
椎板咬骨钳	精细科学工具	11223-20	初始解剖镊子
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
微型水道载玻片	Bioptechs	130119-5
显微镜载玻片	Fisher	12-544-3	荧光素载玻片
显微镜载物台插件	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
目标加热系统	Okolab		Oko Touch 配物镜卡环
油镜 - A型	尼康	已停止
Plan Apo VC 100倍 1.40 NA 物镜	尼康	MRD01901
氯化钾	费希尔	P217
磷酸钾	Sigma-Aldrich	P0662
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
注射泵	Sage Instruments	Model 355
管路适配器 - 阴性端	Small Parts 公司	1005109
管路接头 - 雄性	Small Parts 公司	1005012
Tygon 管	Bioptechs		1/16英寸内径，1/32英寸壁厚
Vannas弹簧剪	精细科学工具	15018-10	精细剪刀