双光子显微镜用于成像小鼠幼崽的神经元形态

摘要

来源： Mizuno, H., et al. In Vivo 新生小鼠皮层神经元的双光子成像. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用双光子显微镜对一只麻醉的转基因幼鼠脑内神经元进行成像的过程。双光子激光能够实现更深的组织成像，具有高空间分辨率和最小化的光散射，从而可精细捕捉神经元的形态结构，包括树突投射。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 颅窗制备

1. 使用异氟烷（1.0% - 2.0%）对幼鼠进行麻醉，并通过夹尾试验检测麻醉深度。
2. 使用灭菌的剃须刀片小心地打开颅骨，保持硬脑膜完整（直径约1 mm）（图1C）。将明胶海绵用灭菌剪刀剪成小块（体积约 < 2 mm³），用镊子夹取并浸入皮层缓冲液（125 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、10 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸）、2 mmol/L CaCl₂ 和 2 mmol/L MgSO₄；pH 7.4；300 mOsm/L；室温）中，用于止血。在打开颅骨过程中，应持续滴加皮层缓冲液以保持脑表面湿润。
3. 使用明胶海绵清除硬脑膜表面的缓冲液和血液。使用黄色枪头将一层1.0%低熔点琼脂糖（溶于皮层缓冲液）均匀覆盖于硬脑膜上。使用加热块装置将琼脂糖溶液温度维持在42°C直至使用。
   注意： 清除缓冲液和血液时，应从颅骨开窗侧进行操作，注意干燥的明胶海绵不得直接接触硬脑膜，否则可能造成硬脑膜损伤。
4. 将圆形玻璃盖玻片（No. 1，直径3 mm）放置在琼脂糖凝胶层上。通过在盖玻片与琼脂糖层之间加入过量琼脂糖凝胶以排除所有气泡。使用镊子去除盖玻片下方溢出的多余凝胶（图1D 和 1E）。
5. 使用牙科水泥固定盖玻片（图1F）。
6. 将牙科水泥粉与液剂混合，使用黄色枪头在混合物凝固前进行涂抹。切勿将牙科水泥直接涂于硬脑膜上，以免损伤脑组织。
7. 使用牙科水泥将无菌钛棒（定制，约30 mg，见 图1G）固定于颅骨上。调整钛棒与盖玻片（位于硬脑膜表面）保持平行，以便于后续成像。
8. 用牙科水泥覆盖暴露的颅骨区域（图1H）。
9. 使幼鼠从麻醉中恢复，并将其置于加热板（37 °C）上直至牙科水泥完全固化（约1小时）。

2. 双光子成像

1. 设置双光子激光波长。激发RFP（红色荧光蛋白）时，使用1,000 nm（在400 µm深度处功率为450 mW/mm²）。
   注意：随着z轴位置上升，应逐步降低激光功率。
2. 用70%乙醇擦拭盖玻片表面。
3. 使用异氟烷（1.5% - 2.0%）对幼鼠进行麻醉，并通过夹尾试验检测麻醉深度。
4. 使用固定在幼鼠头部的钛条，将幼鼠连接到成像平台上的钛板（图2A 和 2B）。调节头部位置，使盖玻片与物镜平行，使用测角仪平台进行校准（图2B）。使用加热垫维持幼鼠体温（37 °C）。
5. 将异氟烷浓度设定为0.7% - 1.0%。
   注意：过高的异氟烷浓度可能导致幼鼠在成像过程中意外死亡。
6. 将成像平台置于双光子显微镜的物镜（20X，NA 1.0）下方（图2B 和 2C）。
7. 在盖玻片上滴加一滴水。使用落射荧光定位硬脑膜暴露区域中标记有荧光蛋白的神经元。
8. 以1.4-µm的间隔采集z轴堆栈图像。对第4层神经元成像时，将z轴扫描范围设为150 - 300 µm，以完整获取树突形态（图2D 和 2E）。采用慢速扫描和图像平均技术，以获得清晰显示神经元形态的图像（通常需要 > 20 分钟才能完成整个树突形态的采集）。
   注意： 推荐以下成像参数：激发波长：1,000 nm，扫描器类型：检流计型，二向色镜：690 nm，发射滤光片：575 - 620 nm带通，探测器类型：GaAsP型，增益设置 > 100，图像尺寸 > 512 x 512 µm，视场 > 600 x 600 µm，像素分辨率 < 1.2 µm。

结果

图1：手术、颅窗制备及钛棒固定。（A）此图显示去除覆盖颅骨的皮...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pK031. TRE-Cre	作者	-	可从 RIKEN BRC 和 Addgene 获取
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	作者	-	可从 RIKEN BRC 和 Addgene 获取
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	作者	-	可从作者处获取
异氟烷	Wako	099-06571
410 麻醉仪（异氟烷气体麻醉机）	Univentor	8323101
Vetbond（组织粘合剂）	3M	084-1469SB
MµltiFlex 圆头（加样头）	Sorenson	13810
Gelfoam（明胶海绵）	Pfizer	09-0353-01
琼脂糖	Sigma	A9793	低熔点
圆形盖玻片	Matsunami	-	定制
Unifast 2（牙科水泥）	GC	-
钛棒	作者	-	定制（见图1G）
Rimadyl（卡洛芬）	Zoetis	-	注射用
双光子显微镜	Zeiss	LSM7MP
钛蓝宝石激光器	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
钛板	作者	-	定制（见图2A）
IMARIS、FilamentTracer、MeasurementPro	BITPLANE
测角仪载物台	Thorlabs	GN2/M