用于研究钙瞬变的生物发光成像 果蝇 脑结构

摘要

来源： Lark, A. R., et. al.，基于生物发光钙指示剂GFP-aequorin的活体功能脑成像方法。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用绿色荧光蛋白-腔肠素生物发光技术对果蝇（Drosophila）脑深部结构中钙离子动态进行的实时成像。

方案

1. 成像

1. 设置
   1. 启动显微镜、计算机、相机和引流系统，并将室温环境控制设置为 25 °C，以开启记录系统。
   2. 在计算机上打开 Measurement and Automation Explorer 程序。点击“Devices and Interfaces”，然后双击“NI Motion Devices”，最后右键点击“PCI-7334”并选择“initialize device”。
   3. 打开 Photon Imager。创建一个新文件夹并命名第一个记录文件。相机必须达到 -80 °C 后系统才能正常运行。
   4. 设置灌流系统：将 KCl（氯化钾）、尼古丁和任氏液（Ringer’s solution）加入储液罐中，并调节使每种溶液以 2 ml/min 的速度流出。实验开始前用任氏液冲洗系统。
2. 准备样品
   1. 将成像固定块培养皿置于显微镜载物台上，在 5X 放大倍数下将灌流管通过穿刺孔插入通道中。
   2. 将显微镜设为荧光模式，居中并对准蘑菇体（MBs）。切换至 20X，重新居中并调焦。
   3. 将引流装置置于引流池上方，调节引流管高度，使其尖端略高于池面，并运行任氏液 30 秒以确保引流通畅。
   4. 拉下遮光罩以隔绝光线。使用光子成像仪中的自动系统进行精细调焦，并拍摄蘑菇体（MBs）的参考荧光图像。
3. 记录
   1. 将光子采集速度调整至所需记录速度（从 50 毫秒到 1 秒或更长）。选择光子模式并打开快门。在记录日志中登记基因型、性别、年龄和样品编号。通过点击并按住 Control 键拖动 ROI（感兴趣区域）框，将其精确调整至萼部和细胞体（CCB）以及内侧叶区域。
   2. 记录约 5 至 10 分钟的基础荧光信号（根据需要设定）。
   3. 施加尼古丁 1 分钟。在日志中记录起止时间。随后用任氏液冲洗 5 分钟。
   4. 等待 5 分钟以恢复，并准备 KCl（氯化钾）处理的日志记录和计时器。
   5. 施加 KCl 1 分钟。在日志中记录起止时间。随后用任氏液冲洗 1 分钟。
   6. 切换至荧光模式，拍摄最终荧光图像，并关闭任氏液灌流。
   7. 点击“Stop”按钮。弹出对话框询问是否关闭系统。选择“否”以继续下一轮记录。
   8. 打开遮光罩，移开引流系统，将物镜切换回 5X，并拔出灌流管。从载物台上取下样品/记录用培养皿，并用水冲洗并擦拭 20X 物镜两次以清洁镜头。
   9. 点击程序窗口顶部的白色播放按钮，启动下一次记录。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Sigma-Aldrich	S3014
氯化钙	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
氯化钾	Prolabo	26 764.298
氯化镁	Prolabo	25 108.295
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
尼古丁	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物
苯甲酰腔肠素	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
移液器吸头	Corning Incorporated	4868	100-1000µL 通用移液器吸头
EM-CCD 相机	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon（冷却至 -80°C）
显微镜	Nikon	N/A	Eclipse-E800
浸油物镜	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
带荧光功能的解剖显微镜	Leica MZ Fl III	N/A	Leica 解剖显微镜及荧光灯
蠕动泵	Gilson	N/A	Minipuls 2
管路	Fisher Scientific	取决于厚度	Tygon R3603, St-Gobain
灌流系统	Warner	64-0135 (VC-66CS)	灌流阀控制系统，完整型，带夹管阀，6通道
灌流调节器	Leventon	201108	Dosi-flow 3
测量与自动化管理器	Sciences Wares & National Instruments	N/A	软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
光子成像软件	Science Wares & National Instruments	N/A	软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
光子查看软件	Science Wares & National Instuments	N/A	软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	软件 https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	软件 http://virtualdub.sourceforge.net/