来源： Muto, A., et al．利用双光子激光消融神经元群体并结合钙成像与斑马鱼幼鱼行为记录进行评估．J. Vis. Exp. (2018)
在本视频中，展示了一种双光子激光消融技术，可实现对琼脂糖固定的斑马鱼幼体中荧光标记神经元的选择性破坏。通过在操作前后进行高分辨率成像，可确认神经元损伤的有效性，表现为荧光信号的消失。
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方法文章
利用双光子显微镜在斑马鱼幼体中进行靶向神经元消融
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2025年5月29日
本文内容
摘要
方案
- 使用双光子激光显微镜消融特定神经元亚群
首先将标记待研究特定神经元的 Gal4 品系与 UAS:EGFP 或 UAShspzGCaMP6s 进行杂交配对。确保双亲均使用 nacre 背景，以便获得 nacre 纯合子。
注意： nacre 纯合子在体表无黑色素细胞（图 1B）。本研究中使用的 Gal4 品系包括 gSAIzGFFM119B（标记顶盖前区）和 hspGFFDMC76A（标记下丘脑叶 ILH）。在完成杂交配对的次日，收集斑马鱼卵，并将其培育至幼体阶段，此时目标神经元将表达荧光报告基因。
将斑马鱼幼体固定于 2% 低熔点琼脂糖中（图 1B）。
首先配制2%琼脂糖储备液：将2 g低熔点琼脂糖粉末加入100 mL系统用水（即，用于在循环水系统中饲养成年斑马鱼的水）或E3水，用微波炉加热至沸腾，并充分混匀。
将2%低熔点琼脂糖储备液用微波炉加热至沸腾。取3.5–4.0 mL琼脂糖溶液倒入6 cm培养皿的皿盖上。待琼脂糖冷却至触感温热后，再进行下一步操作。
接着，将一条幼鱼（此步骤无需麻醉）放入琼脂糖中。使用解剖针（图1C）不断调整幼鱼的位置和方向，使其保持直立，直至琼脂糖完全凝固，以确保幼鱼处于正确位置。
注意：在琼脂糖凝固过程中，幼鱼仍会持续游动。幼鱼定位完成后，静置5分钟，使琼脂糖完全凝固。
向琼脂糖上加入5 mL三卡因溶液（工作浓度为0.4%）。
注意：为避免激光消融过程中幼鱼移动，必须在整个消融过程中保持幼鱼处于麻醉状态。
使用双光子激光显微成像系统中的漂白功能消融幼虫。
将琼脂糖包埋的幼虫置于双光子激光扫描显微镜下，并启动显微镜系统。
启动图像采集软件，点击“Laser”选项卡中的“On”按钮以开启激光器 （图 1D）。等待激光器的“Status”从“Busy”变为“Mode-locked”。
在“Channels”选项卡中，为EGFP（增强型绿色荧光蛋白）消融将激光波长设为880 nm（最大功率：约2,300 mW），或为GCaMP消融设为800 nm（最大功率：约2,600 mW）。
通过手动旋转物镜转盘选择20X物镜。点击“Locate”选项卡，点击“GFP”（绿色荧光蛋白）以切换光路，并通过肉眼直接观察荧光信号。
将斑马鱼幼体脑部置于视野中央；然后点击“Acquisition”选项卡返回双光子显微镜模式。
作为消融前状态的记录，使用20X物镜以快速扫描速度获取z轴层扫图像（以避免热损伤）。随后对比消融实验前后所采集的图像（图 2A）。为获取z轴层扫图像，点击“Z-Stack”以选择z-stack模式并展开该选项卡。聚焦于幼体脑部腹侧末端后，设置下限（点击“Set First”按钮）；聚焦于脑部背侧最表面后，设置上限（点击“Set Last”按钮）。然后点击“Start Experiment”按钮开始z轴层扫图像采集。
通过手动旋转物镜转盘选择63X物镜。
点击“Locate”选项卡切换至落射荧光显微模式，通过肉眼将待消融细胞置于视野中央，然后点击“Acquisition”选项卡返回激光扫描显微模式。
在“采集模式”选项卡中，将“帧大小”设置为 256 × 256。点击“实时”并观察目标神经元。
从背侧最上方开始，找到一个焦平面，使待消融的细胞处于清晰对焦状态。
使用“区域”功能，在每个神经元上标记一个直径约为细胞大小三分之一的小圆形区域作为兴趣区域（ROI）。
将扫描速度设置为13.93 s/256 × 256像素（134.42 µm × 134.42 µm），对应激光驻留时间约为200 µs/像素，或200 µs/0.5 µm。同时设置4次重复（“迭代周期：4”）。或者，可优化迭代次数和扫描速度，以确保实现充分的消融。
使用软件中的“漂白”功能进行消融，并结合“时间序列（2个循环）”对样品在消融前后进行成像，同时使用“区域”功能（用于设置感兴趣区域，ROI）或所用软件中的等效功能（图1D） .
通过比较时间序列循环中的第一幅图像（消融前）和第二幅图像（消融后），确保在漂白后，靶细胞中的荧光强度降低至与背景水平相当的程度图 2B).
如果消融后仍存在荧光，则增加迭代次数。
接下来，将焦平面略微向下移动（即，朝向腹侧），并选择下一个出现未消融细胞的焦平面。
执行漂白功能。重复这些步骤，直至目标神经结构中的所有细胞均被消融。
在扫描完覆盖待消融神经结构的所有焦平面后，检查细胞的荧光是否已消失。若发现部分细胞因消融不充分仍具有荧光，应按照上述方法再次进行激光照射。
如果需要在激光照射后从琼脂糖中回收幼虫，请勿强行将其从琼脂糖中推出，以免损伤幼虫。相反，应小心地在幼虫周围垂直于其体表方向对琼脂糖进行微小切割。随后，等待麻醉效果消退后幼虫自行游出琼脂糖。
继续对下一个幼虫进行消融，或使用与所研究行为无关的另一群神经元进行对照实验。
注意： 此处，作为对照，采用上述相同方案，对 UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B 幼虫中的嗅球神经元进行激光消融图 2A，右侧。在进行钙成像或行为记录之前，需让样本恢复数小时至一天。在此恢复期间，检查幼虫的健康状况即，正常自发游泳，消融区域周围无明显热损伤， 等等。）并移除任何显示健康状况不良的幼虫。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NuSieve GTG 琼脂糖 | |||
| 6 cm 培养皿 | |||
| 解剖针 | |||
| LSM7MP | |||
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | |||
| Imager.Z1 | |||
| ZEN | |||
| Secure-Seal 杂交腔室垫圈，8 个腔室，直径 9 mm × 深度 0.8 mm | |||
| 成像腔室 | |||
| 手术刀 | |||
| ORCA-Flash4.0 | |||
| HCImage | |||
| 硬盘记录模块 | |||
| SZX7 | |||
| DF PL 0.5X | |||
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | |||
| XIMEA xiQ 相机 | |||
| 环形 LED 灯 | |||
| 尼龙筛网 32µm | |||
| 尼龙筛网 13µm | |||
| 金属筛网 150 微米孔径 | |||
| 金属筛网 75 微米孔径 | |||
| EBIOS | |||
| LabVIEW | |||
| Mai-Tai HP |
