使用双光子显微镜对斑马鱼 Larava 进行靶向神经元消融

摘要

资料来源：武藤， A.， {{}}et al。使用双光子激光消融斑马鱼幼虫的神经元种群及其使用钙成像和行为记录的评估。J. 相对于实验 （2018）

在这个视频中， 展示了一种双光子激光消融程序，能够选择性破坏琼脂糖固定的斑马鱼幼虫中的荧光神经元。手术前后的高分辨率成像证实了有效的神经元损伤，如没有荧光所观察到的那样。

方案

<

1. span style='color：black;'> 使用双光子激光显微镜消融神经元亚群

1. 首先设置标记要研究的特定神经元的 Gal4 线与 UAS：EGFP 或 UAShspzGCaMP6 的配接。请务必为父nacre背景，以便获得nacre纯合子。
   注意：nacre体表上不包含黑素细胞（图 1B).在本研究中，使用了 Gal4 系 gSAIzGFFM119B（标记前盖）和另一个 Gal4 系 hspGFFDMC76A（标记 ILH（下丘脑叶）。

2. 在交配设置的第二天，收集斑马鱼卵，并将它们饲养到幼虫阶段，此时感兴趣的神经元将表达荧光报告基因。

3. 将斑马鱼幼虫安装在 2% 低熔点琼脂糖中（图 1B）。

1. 首先制备 2% 琼脂糖储备液：将 2 g 低熔点琼脂糖粉末溶于 100 mL 系统水中（即，用于在循环水系统中维持成年斑马鱼的水）或 E3 水，方法是在微波炉中将水加热到沸点，然后剧烈混合。

   1. 将 2% 低熔点琼脂糖原液微波至沸腾。将 3.5-4.0 mL 琼脂糖倒在 6 cm 培养皿的盖子上。等到琼脂糖冷却，使其摸起来很热，然后再继续。

   2. 接下来，将单个幼虫（在此步骤中未麻醉）放入琼脂糖中。使用解剖针（图 1C）不断调整幼虫的位置和方向，使其直立，直到琼脂糖凝固以确保幼虫的正确定位。
      注意：当琼脂糖凝固时，幼虫将继续游来游去。

   3. 放置幼虫后，等待 5 分钟让琼脂糖完全凝固。

   4. 将 5 mL 三卡因溶液（0.4%，1x 工作浓度）倒在琼脂糖上。
      注意：为避免幼虫在激光消融过程中移动，在整个消融过程中必须保持幼虫的麻醉状态。

<
4. p style='border-style：none;padding：0cm;'>在双光子激光显微镜系统中使用漂白功能消融幼虫。

1. 将琼脂糖包埋的幼虫放在双光子激光扫描显微镜下，然后启动显微镜系统。

2. 启动图像采集软件，然后单击"Laser"选项卡上的"On"按钮以打开激光<span style='background-color：white;color：#1A202C;'>（图 1D）.等待激光器的 "Status" 从 "Busy" 变为 "Mode-locked"。

3. 在"通道"选项卡上，将激光波长设置为 880 nm（最大功率：约 2,300 mW）用于 EGFP（增强型绿色荧光蛋白）消融，或 800 nm（最大功率：约 2,600 mW）用于 GCaMP 消融。

4. 通过手动移动镜头旋转器来选择 20 倍物镜。点击"定位"选项卡，点击"GFP"（Green Fluorescent Protein）改变光路，直接用肉眼查看荧光。

5. 在视图中央找到斑马鱼幼虫的大脑;然后单击"采集"选项卡返回双光子显微镜。

6. 作为"烧蚀前"状态的记录，用 20 倍物镜以快速扫描速度拍摄 z 轴堆栈图像（以避免热损伤）。稍后比较消融实验前后拍摄的图像（图 2A）。要获取 z 堆栈，请单击"Z-Stack"以选择 z 堆栈选项并展开选项卡。在聚焦幼虫大脑的腹侧端后设置下限（单击"设置第一个"按钮），在聚焦于大脑的最背侧表面后设置上限（单击"设置最后一个"按钮）。然后，单击 "Start Experiment" 按钮运行 z 堆栈图像采集。

7. 通过手动移动镜头旋转器选择 63X 物镜。

8. 单击"定位"选项卡切换到落射荧光显微镜，在眼睛的视图中心找到要烧蚀的细胞，然后单击"采集"选项卡返回激光扫描显微镜。

5. 在"采集模式"选项卡上，将"帧大小"设置为 256 x 256。单击 "Live" 并观察感兴趣的神经元。

6. 从最背侧开始，找到要消融的细胞聚焦的焦平面。

7. 使用"区域"功能在每个神经元上标记一个大约细胞直径三分之一的小圆形区域作为感兴趣区域 （ROI）。

8. 将扫描速度设置为 13.93 s/256 x 256 像素 （134.42 μm x 134.42 μm），这对应于大约 200 μs/像素或 200 μs/0.5 μm 的激光停留时间。此外，设置 4 次重复 （'Iteration cycle： 4'）。或者，优化迭代次数和扫描速度，以实现足够的消融。

9. 执行"漂白"功能进行消融，结合"时间序列（2 个周期）"对样品（消融前后）和"区域"（设置 ROI）进行成像，或使用软件中的等效功能（图 1D）。

10. 通过比较时间序列周期中的第一张图像（消融前）和第二张图像（消融后），确保在漂白后，目标细胞中的荧光降低到在背景水平上观察到的荧光（图 2B）。

11. 如果消融后荧光仍然存在，请增加迭代次数。

12. 接下来，将焦平面稍微深一点 （即，朝向腹侧），然后选择出现未消融细胞的下一个焦平面。

13. 执行漂白功能。重复这些步骤，直到感兴趣的神经结构中的所有细胞都被消融。

14. 在穿过覆盖要消融的神经结构的所有焦平面后，检查细胞是否消除了荧光。如果发现一些细胞由于消融不足而仍然发出荧光，请按照上述方法再次对其进行激光照射。

15. 如果在激光照射后需要从琼脂糖中回收幼虫，请不要试图将其从琼脂糖中挤出，因为这可能会损坏幼虫。相反，小心地在幼虫周围的琼脂糖上垂直于其身体表面进行微小的切割。然后，等待幼虫在麻醉剂消失时自行从琼脂糖中游出。

16. 继续对下一个幼虫进行消融，或使用与所调查行为无关的另一群神经元进行控制实验。
    注意：在这里，作为对照，UAS：EGFP; gSAIzGFFM119B 幼虫中的嗅球神经元使用上述相同的协议进行激光消融（图 2A，右）。

17. 在进行 Ca 成像或行为记录之前，请等待几个小时或 1 天进行恢复。在此恢复时间内，检查幼虫健康状况（即，正常的自发游泳，消融区域周围没有明显的热损伤，etc.）并清除出现任何迹象的幼虫健康状况不佳。

结果

材料