双光子显微成像技术用于小鼠脑微血管的活体成像

摘要

来源： Nishimura, C. 等 利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构。 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了利用双光子显微镜对小鼠大脑皮层毛细血管进行活体成像的方法。内容包括在具有薄颅窗的麻醉小鼠体内注射荧光染料的操作步骤、成像系统的准备，以及获取用于分析的脑微血管结构的详细图像。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 荧光染料的注射

1. 使用 #5 镊子夹住麻醉小鼠左侧大腿内侧的皮肤。轻轻向上提起皮肤，并用剪刀剪除皮肤。制备葡聚糖偶联的红色发射罗丹明染料（70 kDa）（10 mg/kg，溶于生理盐水）。
2. 定位股静脉。使用带 30 G 针头的 1 ml 注射器，吸取先前配制好的适用于成像的荧光染料至注射器 130 µl 刻度线处。通过将染料完全吸入注射器并轻弹注射器壁，彻底排除所有气泡。
   1. 将 30 G 针头的斜面朝上，压在硬质表面上，弯折成约 30 度角。用染料充满针头后排出多余液体，保留 100 µl 样品。
3. 将 100 µl 染料缓慢注入股静脉。拔出针头后，对注射部位施加稳定而轻柔的压力以止血。让染料循环 5 分钟。
4. 用 4-0 缝线缝合左侧大腿皮肤，然后小心地将小鼠翻转至俯卧位，并将其固定于小鼠头部固定板装置中。
   

2. 体内 双光子成像

1. 将手术装置移至双光子显微镜下，确保麻醉水平持续维持。在头颅固定板的储液槽中加入少量0.9%生理盐水，并降低显微镜物镜，使其与生理盐水接触。使用明场成像物镜定位目标区域。
2. 将双光子激光激发波长设置为适用于荧光染料的波长。使用25倍物镜开始双光子成像。
   需注意，在本实验中我们使用了一种与红色发射罗丹明染料偶联的葡聚糖，其激发波长为780 nm。采用607/36带通发射滤光片检测染料的荧光信号，采用480/20带通发射滤光游戏副本检测动脉自发荧光。
3. 在视野屏幕上定位毛细血管床，并使用2倍光学变焦放大该区域。利用双光子成像软件采集毛细血管图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 异氟烷蒸发器	Datex Ohmeda	447
超精细波恩剪刀	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 镊子	Fine Science Tools	11295-10
Texas Red-葡聚糖（70,000 分子量，10 mg/kg 溶于生理盐水）	Invitrogen	D-1830
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子显微镜	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa 激光器	Spectra-Physics
Amira 软件	Visage Imaging