来源： Pigazzini, M. L., 等 衰老过程中淀粉样结构的表征 秀丽隐杆线虫 使用荧光寿命成像 J. Vis. Exp. (2020).
本视频展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）评估秀丽隐杆线虫（C. elegans）神经元中多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白的聚集情况，并比较对照组与分子伴侣蛋白缺陷型线虫。分子伴侣缺陷型线虫中蛋白聚集增加，促进了聚集荧光团之间的能量转移，从而缩短荧光寿命。FLIM生成的彩色编码图谱呈现了这些差异，突显了不同实验组之间的聚集水平差异。
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方法文章
多聚谷氨酰胺蛋白聚集的荧光寿命成像在 秀丽隐杆线虫 神经元
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2025年6月17日
本文内容
摘要
方案
1. FLIM 数据的采集
注意：在本方案中，荧光探针的寿命通过时间域 TCSPC 方法获取。荧光寿命成像（FLIM）需要激光以设定且恒定的重复频率产生光脉冲。重复频率因激光器类型而异，用户需明确所用激光器的频率参数。寿命测量通过安装在常规显微镜旁的探测器和电子设备实现。本方案中，测量在三台不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行，探测器和软件分别由两家不同公司提供（材料表），分别用于获取 mRFP、CFP 和 YFP 的寿命。开始实验前，请确认已正确安装相应的激发/发射滤光片，并尽量减少背景光或显示器背光干扰。在开展任何实验之前，应先评估所选荧光探针的光稳定性。若该荧光探针在短时间内即在秀丽隐杆线虫（C. elegans）组织中发生漂白，则不适用于在该模式生物中进行荧光寿命成像测量。
- 打开 FLIM 采集软件。该 FLIM 软件还可用于控制共聚焦显微镜。找到允许启用探测器输出的选项卡/按钮，然后点击 启用输出。
- 采集仪器响应函数（IRF），该函数用于描述仪器设置的时间精度。
注意： 此步骤最好在装载线虫之前完成。- 如有条件，移除激发/发射滤光片。
- 将一块空白盖玻片置于物镜上方，找到其表面。记录盖玻片散射信号，持续时间不少于 30 秒。
注意： 对于持续数纳秒的荧光寿命，采集软件可自动估算 IRF 的偏移量。建议始终采集 IRF。
- 将载有 C. elegans 的载玻片放置于载物台上。使用 10 倍物镜在透射光模式下定位线虫在载玻片上的位置。
- 取下载玻片，将物镜切换至 63 倍，并添加所需的浸没介质（例如油）。将载玻片重新放回载物台，并重新定位线虫。
- 在采集软件中找到 针孔管理器 并将其设置为 最大。开始扫描样品，选择一个感兴趣区域（例如头部、上半身），并聚焦于其最大投影平面。
- 监控激光脉冲频率以及软件界面上显示的另外三个参数：恒定分数判别器（CFD）、时间-幅度转换器（TAC）和模数转换器（ADC）。
注意： 激光器的单光子计数应达到最大值 1 × 108。该数值代表激光器提供的最大光子数。CFD 提供探测器接收到单光子脉冲相对于激光脉冲的时间信息，该值应约为 1 × 105。TAC 用于区分一个光子被探测到的时间与下一个激光脉冲之间的时间差。最后，ADC 将 TAC 的电压信号转换为可存储的数字信号。CFD、TAC 和 ADC 的数值应大致相近，以确保荧光团发射的光子不会丢失。正确评估这些参数可确保采集到足够数量的光子，以生成准确的寿命图。 - 在 FLIM 软件界面上预览探测到的光子数量：ADC 值应在 1 × 104 至 1 × 105 之间。如有必要，可调整焦平面或提高激光功率以采集更多光子。
注意： 通常情况下，每秒记录的光子数不应超过激光重复频率的 1%。 - 在菜单栏中，选择设置采集参数的选项卡。选择 扫描同步输入，以启用单光子检测。
- 将采集设置为固定时间或固定光子数。例如，采集 2 分钟的寿命衰减曲线，或直到单个像素达到 2,000 次单光子事件。点击 开始 以开始采集。
注意： 不同的荧光团需要不同的激发和发射激光及滤光片。根据样品的亮度，可调节激光功率，这不会影响荧光寿命。本实验方案采用以下激发/发射设置：YFP ex500/em520-50 nm，mRFP ex561/em580-620 nm。CFP 测量采用脉冲双光子激光器，设置为 ex800/em440 nm。采集 FLIM 图像所需的时间和光子计数需根据每种实验装置和具体实验目的通过经验确定。
使用 FLIMfit 软件分析 FLIM 数据
注意：使用伦敦帝国理工学院开发的 FLIMfit 软件工具进行数据分析（见图1）。
- 打开软件，通过以下方式导入 FLIM 数据文件 文件 | 加载荧光寿命成像数据. 加载同一条件下的所有样本，即使这些样本来自不同的实验批次和不同的生物学重复。
- 如有必要，可通过以下方式从任意一张 FLIM 图像中分割出单个线虫 分割 | 分割管理器. 拖动裁剪工具围绕目标区域，直至该区域被高亮显示。完成后，按 OK.
注意： 所有图像都必须进行分割。 - 选择强度图像中信号较强的微小区域 C. elegans 出现（图1，箭头1）。该区域的衰减曲线将显示在界面右侧较大的衰减窗口中（图1，箭头2）。
注意： 衰减可以线性或对数形式显示。 - 根据步骤 2.5–2.8 中所述，设置正确的参数，通过软件算法对外推荧光寿命进行计算。
- 在 数据 标签图1，箭头3）：
- 设定一个任意值 综合最小值 值，以排除过于昏暗而无法产生良好拟合的像素。根据具体情况 C. elegans 该值在40至300之间变化。输入不同的数值，直至获得满意的预览效果。
- 选择一个 时间 分钟 和一个 时间最大值 通过设定数值以将 FLIM 信号限制在该范围内，所有早于和晚于该阈值的事件将被排除。
注意： 例如，在分析 mRFP 时，排除了早于 800 ps 和晚于 4,000 ps 的事件。这些数值取决于荧光团的寿命，需由最终用户自行确定。 - 请勿更改预设设置 光子计数/光子 1 的
- 输入 重复频率，单位为 MHz，表示采集过程中所用激光的频率。
注意： 在本方案中，使用了具有不同重复频率的多种激光器。用于采集CFP寿命的双光子激光器的重复频率为80 MHz，用于YFP的激光器重复频率为40 MHz，而用于mRFP的则为78.01 MHz。这些数值根据所分析的样品输入至FLIMfit软件中。 - 输入 A 门控最大值 排除所有饱和像素的值。
注意： 用于寿命测量的 秀丽隐杆线虫，该值可设为任意较大的数值（例如 1 x 108).
- 在 寿命 标签，选择要使用的全局拟合方式（例如，逐像素拟合）。参见 图1，箭头4。
注意： A 逐像素 拟合将对每个单独的像素生成一个衰减拟合曲线。一个 逐图像 拟合将对每幅单独的图像进行全局拟合，并为每幅图像显示一个单一的寿命值。A 整体上 拟合将对整个数据集生成单一的拟合结果，所有图像均提供一个相同的寿命值。 - 除以下参数外，其他参数均不得更改 实验编号 如果已知所选荧光衰减为多指数衰减且表现出不止一个荧光寿命，则应进行选择。
注意： 在本实验方案中，该函数被用于计算双指数衰减CFP荧光团的荧光寿命。 - 通过 IRF 菜单上传 IRF： IRF | 加载 IRF. 为估算IRF偏移，选择 IRF | 估算 IRF 偏移一组数值将自动显示在 IRF 标签。一旦设定完成，不要更改此标签中的任何其他参数。
- 所有参数设置完毕后，按下 拟合数据集 (图1，箭头5）。该算法将对衰减曲线进行拟合，并为每幅图像确定一个寿命值。
注意： 以蓝色线条突出显示的拟合结果应与所有事件重合。当所有事件均沿拟合线对齐时，即获得良好拟合。 - 单击 参数 标签 (图1，箭头6），位于软件界面右上角菜单中，然后选择 统计量：w_mean（加权平均值） 并检查 chi2 数值尽可能接近 1。
注意： A chi2 接近1可确保拟合的准确性。因此，所选图像的寿命值显示为 tau_1. - 导出任何感兴趣的信息： 文件 | 导出强度图像/拟合结果表格/图像/直方图保存用于计算寿命的数据设置： 文件 | 保存数据设置.
注意： 所采用的参数将被保存，以供后续对所选样本进行分析。
3. FLIM 数据的图形化表示
注意： 来自不同样本的寿命数据可通过多种方式进行可视化呈现。请选择以纳秒或皮秒表示寿命值。
- 通过直接从 FLIMfit 导出衰减曲线，展示拟合质量与曲线的准确性。
- 通过绘制光子计数频率相对于寿命值的直方图，表示光子的分布情况。
- 最后，进行统计学比较时，若需比较两个或多个样本，将寿命值及其均值的标准差以散点图柱状图形式呈现，并执行所需的统计分析。
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结果
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨苄青霉素 | |||
| B&H DCS-120 SPC-150 | |||
| B&H SPC830-SPC Image | |||
| C. elegans nQ40-CFP | |||
| 盖玻片-18x18mm | |||
| Leica M165 FC | |||
| Leica TCS SP5 | |||
| 盐酸左旋咪唑 | |||
| PicoQuant PicoHarp300 | |||
| 叠氮化钠 | |||
| 标准载玻片 | |||
| 通用琼脂糖 | |||
| Zeiss AxioObserver.Z1 | |||
| Zeiss LSM510-Meta NLO |
