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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 获取FLIM数据
注：{{TAG_14在该实验方案中，荧光团的寿命是通过时域TCSPC方法获得的。FLIM 要求激光以固定且恒定的重复频率产生光脉冲。重复频率根据激光器类型而变化，需要用户知道。寿命测量是通过安装在传统显微镜旁边的探测器和电子设备来实现的。在该协议中，使用由两家不同公司提供的探测器和软件在三种不同的激光扫描共聚焦显微镜上进行测量 （材料表） 分别用于获取 mRFP、CFP 和 YFP 寿命。检查发射/激发滤波器是否正确，并在开始之前尽量减少任何背景或监视器背光。在开始任何实验之前，请确定所选荧光团的光稳定性。如果荧光团在线虫组织内短时间内漂白，则不适合用于秀丽隐杆线虫的FLIM测量。
- 打开 FLIM 采集软件。FLIM 软件还允许控制共聚焦显微镜。找到允许启用检测器输出的选项卡/按钮，然后按 启用输出。
- 获取 instrument response function （IRF），它描述了 instrumental setup 的 timing precision。
注： 此步骤最好在上线虫之前进行。- 如果可用，请移除激发/发射滤光片。
- 将空盖玻片放在物镜上方并找到其表面。记录从盖玻片获得的散射信号至少30秒
注：对于几纳秒的寿命，采集软件可以自动估计IRF偏移。始终建议获取 IRF。
- 将载有 秀丽隐杆线虫 的载玻片放在载物台上。在透射模式下使用 10 倍放大镜头并定位载玻片上线虫的位置。
- 取下载玻片，将物镜切换到 63 倍放大镜，并涂抹所需的浸入介质（例如油）。更换载玻片并定位线虫。
- 在采集软件上找到针孔管理器，打开它到{{}}最大值。开始扫描样品，选择一个感兴趣的区域（例如，头部、上半身），并专注于其最大投影平面。
- 监控激光脉冲速率和软件界面上的其他三个值：常分数判别器 （CFD），振幅时间 （TAC），以及模数转换器（ADC）。
注：激光器的最大门数应为1 x 108个单光子计数。此数字表示激光器提供的最大光子数。CFD 提供有关探测器相对于激光脉冲接收到的单光子脉冲的信息。此值应大致为 1 x 105。TAC 区分检测到一个光子的时间和下一个激光脉冲的时间。最后，ADC 将 TAC 电压转换为可存储的存储信号。CFD、TAC 和 ADC 都应该具有相似的值，以确保荧光团发射的光子不会丢失。正确评估这些参数可确保收集到足够的光子来创建准确的生命周期图。 - 在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数：ADC 值应在 1 x 104 和 1 x 105之间。如有必要，将焦点转移到不同的平面上或增加激光功率以收集更多光子。
注：一般来说，每秒记录的光子数不应超过激光器重复率的1%。 - 在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。
- 将采集设置为固定的时间量或固定数量的光子。例如，获取 2 分钟的生命周期衰减曲线，或直到单个像素达到 2,000 个单个事件的光子计数。按 开始 开始获取。
注： 不同的荧光基团需要不同的激发和发射激光器和滤光片。根据样品的亮度，还可以调整激光功率，不会影响寿命。这些方案使用以下激发/发射设置：YFP ex500/em520-50 nm、mRFP ex561/em580-620 nm。脉冲双光子激光器用于使用 ex800/em440 nm 的 CFP 测量。需要根据每种设置和每个实验目的根据经验确定获取 FLIM 图所需的时间和光子数。
2. 使用FLIMfit软件分析FLIM数据
注：使用伦敦帝国理工学院开发的FLIMfit软件工具进行数据分析（见图1）。
- 打开软件，通过 文件 |加载 FLIM 数据。从一种条件下加载所有样品，即使在不同的会话和不同的生物重复序列中获得。
- 如有必要，通过 分割 |细分管理器。在感兴趣区域周围拖动裁剪工具，直到它高亮显示。完成后，按 确定。
注意： 必须对所有图像进行分割。 - 选择一个小区域，其中出现秀丽隐杆线虫{{}}图1，箭头1）。该区域的衰减曲线将出现在界面右侧的大衰减窗口中（图 1，箭头 2）。
注：衰减可以线性或对数显示。 - 设置正确的参数以通过软件的算法推断寿命，如步骤 2.5-2.8 中所述。
- 在数据{{}}选项卡（图1箭头3）：
- 设置任意积分最小值值，以排除任何太暗而无法产生适合。根据秀丽隐杆线虫样本，该值在40-300之间变化。输入不同的值，直到获得满意的预览。
- 选择一个时间最小值和一个时间最大值数字，以将FLIM信号限制为这些值。在此阈值之前和之后出现的所有事件都将被排除。
注：{{TAG_385 例如，对于 mRFP 的分析，排除了 800 ps 之前和 4,000 ps 之后的事件。这些值取决于荧光基团的使用寿命，需要由最终用户确定。 - 不要更改预设计数/光子为1。
- 输入采集过程中使用的激光器的 重复率，以 MHz 为单位。
注： 对于当前的协议，使用了不同的激光器和不同的重复率。用于采集 CFP 寿命的双光子激光器具有 80 MHz 的重复率，对于 YFP，激光器在 40 MHz 处重复，对于 mRFP，该值为 78.01 MHz。根据分析的样本将这些值输入到 FLIMfit 中。 - 输入 Gate Max 值以排除所有饱和像素。
注： 对于秀丽隐杆线虫的寿命测量，此值设置为任何较大的数字（例如，1 x 108}}）。
- 在 Lifetime 选项卡上，选择要使用的全局拟合（例如，像素级拟合）。见图1，箭头4。
注意：像素级 拟合将产生适合每个像素的衰减。图像级 将生成每个单独图像的全局拟合，并为每个图像显示一个生命周期值。全局将在整个数据集中产生单个拟合。为所有图像提供单个生命周期值。 - 请勿更改除 之外的任何其他参数。如果已知所选荧光衰减是多指数的并且表现出多个生命周期，则 Exp 选择。
注： 在本实验方案中，该函数用于计算双指数 CFP 荧光团的寿命。 - 通过 IRF 菜单上传 IRF：IRF |加载 IRF。要估计 IRF 偏移，请选择 IRF |估计 IRF 偏移。一组值将自动出现在 IRF 选项卡上。一旦建立起来，就不要更改此选项卡的任何其他参数。
- 设置完所有参数后，按拟合数据集 （图 1， 箭头 5）。该算法将生成衰减曲线的拟合，并为每个图像建立生命周期值。
注意： 结果拟合（以蓝线突出显示）应与所有事件重叠。当所有事件都沿拟合对齐时，将获得良好的拟合。 - 点击软件界面右上方菜单中的参数选项卡（图1箭头6），然后选择统计：w_mean（加权平均值），并检查chi2 值尽可能接近 1。
注意：接近 1 的 chi2 可确保拟合的准确性。因此，所选图像的生命周期值显示为 tau_1。 - 导出任何感兴趣的信息：文件 |导出强度图像/拟合结果表/图像/直方图。保存用于计算寿命的数据设置：文件 |保存数据设置。
注： 所采用的参数将被保存，以备将来对所选样品的分析。
3. FLIM数据的图形表示
注：从不同样本中收集的寿命可以用各种方式直观地表示。选择以纳秒或皮秒表示生命周期值。
- 通过直接从 FLIMfit 导出衰减曲线来显示拟合质量和曲线的准确性。
- 通过在直方图中绘制光子计数的频率与寿命值的关系来表示光子的分布。
- 最后，为了进行统计比较，如果比较两个或多个样本，请将生命周期值加上平均值的标准差放在散点图条形图中。执行任何所需的统计分析。
