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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. 用荧光标记标记的外源性凝块的制备（图 1）
- 使用 3% 异氟醚与 30% 氧气（1.5 L/min，100% 氧气）混合，在诱导室中麻醉小鼠。通过观察肌肉张力并确认没有脚趾捏反射，确保足够的麻醉深度。
- 将动物俯卧放在无菌窗帘上，并使用吸入面罩和 2% 异氟醚与 30% 氧气混合保持麻醉状态。使用无菌技术和无菌防护服/口罩/手套/器械执行以下程序。通过在作前后用 70% 酒精清洁和消毒实验区域来保持无菌条件。
- 心脏穿刺后收集约 300 ~ 1,000 μl 动脉血。将 70 μl 全血与 30 μl C15 探针（浓度 20 μmol/L）混合，C15 探针是一种对活化因子 XIII （FXIIIa） 凝血酶的纤维蛋白交联活性敏感的 Cy5.5 荧光探针，以荧光标记凝块（图 1A）。使用 3 ml 注射器（23 号针头）将混合血液注射到 20 cm 长的聚乙烯管（PE-50，内径 0.58 mm）中。PE 管必须经过消毒（或由制造商认证为无菌），并且血凝块必须在组织培养罩中无菌制备。
- 通过观察缺乏呼吸和心跳来验证动物的死亡。
- 将载血管在室温下放置 2 小时，然后在 4 °C 下放置 22 小时，并执行以下程序，如前所述。
- 将含血栓的试管切成 1.5 厘米长的小块。使用装有磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 3 ml 注射器，通过将 PBS 轻轻注入每根试管中，将血栓排出到含有 PBS 的 6 孔板上。用 PBS 洗涤血栓 3 次（图 1B）。
- 小心抽取洗涤过的血栓，同时避免气泡，使用充满盐水的 1 ml 注射器和 30 号针头，将 1.5 cm 长的血栓加载到 15 cm 长的 PE-10 管（内径 0.28 mm）的远端部分插入管的近端插入管的近端。
- 将载有血栓的 PE-10 管与经修饰为锥形端（内径 200 μm）的 3 cm 长 PE-50 管（内径 0.58 mm）连接，该管将放置在大脑中动脉 （MCA） - 大脑前动脉 （ACA） 颈内动脉 （ICA） 分叉区域在栓塞性中风的小鼠模型中（图 1C）。
2. 血栓栓塞性中风小鼠模型建模（图 2）
- 使用 3% 异氟醚与 30% 氧气 （1.5 L/min） 混合，在诱导室中麻醉要卒中的不同小鼠。皮下注射美洛昔康 （5 mg/kg） 以缓解术后疼痛。通过观察肌肉张力并确认没有脚趾捏反射，确保足够的麻醉深度。
- 在每只眼睛上涂抹少量兽用软膏，以防止麻醉时干燥。使用无菌技术和无菌防护服/口罩/手套/器械进行以下外科手术。通过在手术前、手术中和手术后用 70% 的酒精清洁和消毒手术区域来保持无菌条件。
- 将鼠标移动到手术台上。将动物置于俯卧位的无菌窗帘上，并使用吸入面罩和 2% 异氟醚保持麻醉状态。然后，使用带有直肠温度计反馈的恒温毯将体温夹在 36.5 °C。
- 用 betadine 和 70% 酒精进行手术准备后，用手术刀在左耳和眼睛之间的头皮上做一个 1 厘米的垂直切口。将激光多普勒流量计光纤的远端粘合到暴露的左颞骨表面（前囟左侧 1 毫米和下方 4 毫米）上。然后，开始多普勒血流监测（图 2A）。
- 放下动物。用一根连接在销钉上的绳子拉动上门牙，拉直颈部，然后剃掉颈部区域。然后，做一个 3 cm 的垂直中线切口，张开，解剖血管周围软组织，露出左颈动脉球区域。小心不要伤到迷走神经。
- 使用无菌 6-0 黑丝缝合线结扎左近端颈总动脉 （CCA），并使用无菌 7-0 黑丝缝合线结扎左 ICA 和左翼腭动脉 （PPA）。
- 使用单极电灼烧灼左甲状腺上动脉，它是左颈外动脉的一个分支，并使用无菌 7-0 黑丝缝合线松散地结扎左近端颈外动脉 （ECA） 和更远端的部位。
- 使用微型剪刀，在 ECA 的连接部位之间打一个小孔（直径约 0.2 ~ 0.25 μm）。
- 将含血栓的导管插入 ECA 的孔中，同时松开近端 ECA 结扎。将导管推进 CCA 后，再次收紧近端 ECA 结扎，以便将导管收紧到位。
- 烧灼以切割远端连接部位远端的 ECA 远端部分，并顺时针旋转游离近端 ECA 以使其与 ICA 的方向对齐，同时从 CCA 中撤回导管。然后，在松开 ICA 结扎后立即将导管推进至远端 ICA 的 MCA-ACA 分叉区域约 9 毫米。然后，收紧 ICA 结扎。
- 轻轻按压注射器 1 ml 以注射血栓，将血栓放入分叉区域。检查多普勒脑血流量 （CBF） 的减少情况，如果血栓成功阻塞血管，与基线相比，多普勒脑血流量 （CBF） 应降低 30% 或更低（图 2B）。
- 拔除导管，并立即紧紧结扎 ECA 近端部位。此外，取消 CCA 和 PPA 的连接。
- 使用 6-0 丝缝合线闭合切口部位。在所需的时间范围内继续多普勒监测后停止麻醉（此处为血栓注射后 30 分钟）。将鼠标放回空笼子里，用加热灯保持温暖。在鼠标获得足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。
3. 脑血栓的体内 MicroCT 成像（图 3）
- 如步骤 2.1 中所述，在栓塞性中风发作后（此处为 1 小时）用 2% 异氟醚重新麻醉小鼠由于血栓位于脑动脉中。通过确认没有脚趾捏反射，确保足够的麻醉深度。在每只眼睛上涂抹少量兽用软膏，以防止麻醉时干燥。
在 - 10 mM PBS 中以 10 mg Au/ml 的浓度重悬纤维蛋白靶向金纳米颗粒 （fib-GC-AuNP4），并对血栓显像剂超声处理 30 分钟，以确保纳米颗粒的溶解和分散。将 300 μl fib-GC-AuNP （10 mg/ml） 注射到静脉中。
- 将动物放在 microCT 机器的床上，用一根连接到销钉上的绳子拉动上门牙，拉直脖子，以减少运动伪影。
- 注射 fib-GC-AuNP 后 5 分钟，开始获得脑的显微 CT 图像。对于此处描述的实验，使用以下成像参数：65 kVp、60 μA、26.7 x 26.7 x 27.9 毫米3 视野、0.053 x 0.053 x 0.054 毫米3 体素大小、每帧 100 毫秒、一个平均、360 个视图、512 x 512 重建矩阵、600 个切片、64 秒扫描时间。
- 将鼠标放回空笼子中，并用加热灯保持温暖。在鼠标获得足够的意识以维持胸骨卧位之前，不要让鼠标无人看管。
- 使用安装在显微 CT 扫描仪上的软件包中"重建"面板的"开始"命令，将原始图像数据转换为医学数字成像和通信 （DICOM） 格式。
- 对于图像的定量分析（在步骤 6 中），根据制造商的说明使用市售软件包将 DICOM 数据转换为 TIFF 格式。
- 为了以更简单、更快速的方式进行定性分析和定量分析，请使用软件包和 DICOM 格式的原始 0.054 毫米厚图像生成一组新的轴向和冠状度图像，这些图像的厚度为 1 或 2 毫米（此处为 2 毫米），如下所示。
- 在 'Data Source' 树上选择 DICOM 文件夹，单击鼠标右键，然后将该文件夹导入 'MasterDB' 或 'PrivateDB'。
- 单击 'Data Source' 树中的 'MasterDB' 或 'PrivateDB'，然后选择导入的文件夹。单击最左侧面板上的"3D"选项卡后，当弹出"加载选项"窗口时，按"确定"将文件夹中的图像序列作为堆栈导入。
- 通过在轴向和冠状图像窗口中单击"MRP"一词，然后在弹出菜单中选择"MIP"，将图像表示更改为最大强度投影 （MIP） 格式。然后，在同一窗口中单击"TH ： 0 [mm]"后，将图像厚度更改为 2 mm。
- 使用 2 mm 宽的 3D 导航器杆，允许探索图像堆栈并以适当的角度和位置对其进行切片，准备 2 mm 厚的轴向切片图像，完全覆盖包含血栓的 Willis （COW） 圆。单击 'Output' 面板上的捕获按钮（相机图标）。以 TIFF 格式存储图像。
- 然后，准备五个 2 毫米厚的冠状切片图像，这些图像从额叶到小脑连续覆盖。
- 首先，通过小心地将导航杆对准轴向图像来准备第二个切片，以便冠状图像可以最好地可视化 MCA-ACA 血栓。
接下来，以连续的方式准备其他四片。单击 'Output' 面板上的捕获按钮（相机图标）。以 TIFF 格式存储图像。
