利用微型计算机断层扫描成像技术在小鼠中显示脑血栓

摘要

来源： Kim, D., et. al. 结合近红外荧光成像与微型计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用微型计算机断层扫描（micro-CT）成像技术在小鼠中可视化脑血栓的方法。通过向脑血栓小鼠模型注射靶向纤维蛋白的金纳米颗粒作为对比剂，随后将小鼠置于micro-CT设备的载物床上，从多个角度采集图像。使用适当的软件对图像进行重建和处理。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 荧光标记的外源性血栓制备（图1）

1. 使用3%异氟烷与30%氧气（100%氧气流速1.5 L/min）在诱导室中对小鼠进行麻醉。通过观察肌肉张力并确认脚趾夹捏反射消失，以确保麻醉深度足够。
2. 将动物以俯卧位置于无菌铺巾上，并通过吸入式面罩持续给予2%异氟烷与30%氧气以维持麻醉状态。所有操作均需采用无菌技术，并穿戴无菌手术衣、口罩、手套及使用无菌器械。在操作前后，使用70%酒精清洁和消毒实验区域，以维持无菌环境。
3. 经心脏穿刺采集约300 ~ 1,000 µl动脉血。取70 µl全血与30 µl C15探针（浓度为20 µmol/L）混合，该探针为Cy5.5荧光探针，可特异性响应活化凝血因子XIII（FXIIIa）的纤维蛋白交联活性，从而对血凝块进行荧光标记（图1A）。使用3 ml注射器（23号针头）将混合后的血液注入一段20 cm长的聚乙烯管（PE-50，内径0.58 mm）。PE管必须经过灭菌处理（或由制造商提供灭菌认证），且血凝块需在组织培养超净台中无菌制备。
4. 通过观察呼吸和心搏是否停止，确认动物死亡。
5. 将装有血液的管置于室温下静置2小时，随后在4 °C下保存22小时，然后按先前报道的方法进行后续操作。
6. 将含有血栓的管切成1.5 cm长的小段。使用装有磷酸盐缓冲液（PBS）的3 ml注射器，将每段管中的血栓轻轻推入含PBS的6孔板中。用PBS清洗血栓三次（图1B）。
7. 取一段长15 cm的PE-10管（内径0.28 mm），在其远端装入一段1.5 cm长的血栓。操作时，将经PBS洗涤后的血栓通过插入管近端的30号针头（连接装有生理盐水的1 ml注射器）小心吸入，避免产生气泡。
8. 将装载血栓的PE-10管与一段3 cm长、末端经拉细处理的PE-50管（内径0.58 mm，末端内径200 µm）连接，该装置将用于小鼠栓塞性脑卒中模型中，放置于颈内动脉（ICA）的中脑动脉（MCA）–前脑动脉（ACA）分叉区域（图1C）。

2. 建立血栓性脑卒中小鼠模型（图2）

1. 在诱导室中使用含30%氧气（1.5 L/min）的3%异氟烷麻醉另一只小鼠。皮下注射美洛昔康（5 mg/kg）以缓解术后疼痛。通过观察肌肉张力并确认趾夹反射消失，确保麻醉深度足够。
2. 在每只眼睛中涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间眼睛干涩。使用无菌技术及无菌手术服、口罩、手套和器械进行以下手术操作。术前、术中和术后均用70%酒精清洁和消毒手术区域，以维持无菌环境。
3. 将小鼠移至手术台，将其置于无菌铺巾上呈俯卧位，通过吸入式面罩以2%异氟烷维持麻醉。随后，使用直肠温度计反馈的恒温毯将体温维持在36.5 °C。
4. 使用聚维酮碘和70%酒精进行手术区域准备后，用手术刀在左耳与左眼之间的头皮上做一长度为1 cm的垂直切口。将激光多普勒血流仪的光纤远端粘附于暴露的左侧颞骨表面（位于冠状缝左下方1 mm、后方4 mm处）。随后，开始多普勒血流监测（图 2A).
5. 将动物仰卧放置。用系在钉子上的细线拉住上颌门齿以伸直颈部，并剃除颈部区域的毛发。随后，做一条长约3厘米的垂直正中切口，撑开切口，通过分离血管周围软组织暴露左侧颈动脉球区域。注意避免损伤迷走神经。
6. 使用无菌6-0黑色丝线结扎左侧近端颈总动脉（CCA），使用无菌7-0黑色丝线结扎左侧颈内动脉（ICA）和左侧翼腭动脉（PPA）。
7. 使用单极电凝器烧灼左侧甲状腺上动脉（左侧颈外动脉的分支），并用无菌7-0黑色丝线在左侧颈外动脉（ECA）近端进行松扎，远端进行紧扎。
8. 使用显微剪刀在颈外动脉结扎位点之间制作一个小孔（直径约0.2 ~ 0.25 µm）。
9. 将含有血栓的导管插入ECA的孔中，同时松开近端ECA结扎线。将导管向前推进至CCA后，再次收紧近端ECA结扎线，以固定导管位置。
10. 电凝切断ECA远端部分（位于远端结扎位点以远），同时顺时针旋转游离的ECA近端，使其与ICA方向对齐，并在从CCA撤出导管的同时完成操作。随后，在松开ICA结扎后，立即向前推进导管约9 mm，进入远端ICA的MCA-ACA分叉区域。然后重新收紧ICA结扎。
11. 将血栓注入分叉区域，方法是轻压1 ml注射器以注入血栓。检查多普勒脑血流（CBF）的下降情况，若血栓成功阻塞血管，则脑血流应较基线水平降低30%或更多图2B).
12. 移除导管，并立即紧密结扎ECA近端。此外，解除对CCA和PPA的结扎。
13. 使用6-0丝线缝合切口。在持续多普勒监测所需时间（此处为血栓注射后30分钟）后，停止麻醉。将小鼠置于空笼中，并用加热灯保持其体温。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开无人看护。

3. 体内 脑血栓的MicroCT成像（图3）

1. 使用2%异氟烷按照步骤2.1所述方法，在血栓植入大脑动脉引发栓塞性卒中后预设的时间点（此处为1小时）对小鼠进行再次麻醉。通过确认趾夹反射消失来确保麻醉深度充足。在每只眼睛上涂抹少量兽用眼膏，以防止麻醉期间角膜干燥。
2. 将纤维蛋白靶向金纳米颗粒（fib-GC-AuNP4）以10 mg Au/ml的浓度重悬于10 mM PBS中，并对血栓成像剂进行超声处理30分钟，以确保纳米颗粒充分溶解和分散。经阴茎静脉注射300 µl fib-GC-AuNP（10 mg/ml）。
3. 将动物置于微型CT设备的床面上，用系在钉子上的细线牵拉上门齿以拉直颈部，从而减少运动伪影。
4. 注射 fib-GC-AuNP 后 5 分钟开始获取脑部的微计算机断层扫描（micro-CT）图像。本实验采用以下成像参数：65 kVp，60 µA，26.7 x 26.7 x 27.9 mm³ 视野，0.053 x 0.053 x 0.054 mm³ 体素大小，每帧100毫秒，单次平均，360个投影，512 × 512重建矩阵，600层切片，扫描时间64秒。
5. 将小鼠放回一个空的笼子中，并用加热灯保持其温暖。在小鼠恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
6. 将原始图像数据使用“开始“的”命令重建安装在微计算机断层扫描仪上的软件包中的“面板”。
7. 对于图像的定量分析（步骤6），根据制造商的说明，使用商用软件包将DICOM数据转换为TIFF格式。
8. 为了进行定性分析以及更简单、更快速的定量分析，使用软件包及原始的 DICOM 格式图像（厚度为 0.054 mm），生成一组新的轴向和冠状图像，层厚设为 1 或 2 mm（此处为 2 mm），具体步骤如下。
   1. 选择DICOM文件夹在“数据来源树中，单击鼠标右键，将文件夹导入到“MasterDB或PrivateDB.'
   2. 点击“MasterDB或PrivateDB在“数据源”树中展开“，并选择导入的文件夹。单击最左侧面板上的“3D”选项卡后，当“加载选项”窗口弹出时，按下“好的将文件夹中的图像序列作为堆栈导入。
   3. 将图像表示形式更改为最大强度投影（MIP）格式，方法是点击“MRP在轴向和冠状图像窗口中选择“MIP“弹出菜单上的” 。然后，点击“”后将图像厚度更改为 2 mmTH ： 0 [mm]在同一窗口中。
   4. 使用宽度为 2 mm 的 3D 导航条，该导航条可实现对图像堆栈的浏览，并在合适的角度和位置进行切片，制备一幅完全覆盖 Willis 环（COW）的 2 mm 厚轴向断层图像，该区域含有血栓。点击“捕获”按钮（相机图标）输出面板。将图像保存为TIFF格式。
9. 然后，制备五张2 mm厚的冠状切面图像，连续覆盖从额叶到小脑的区域。
   1. 首先，通过在轴向图像上仔细调整导航条的位置，使冠状面图像能够最清晰地显示MCA-ACA血栓，从而制备第二张切片。

接着，以连续的方式制备其余四个切片。点击“输出”面板上的捕获按钮（相机图标）。将图像保存为 TIFF 格式。

结果

图1：荧光标记血栓制备流程概述。 （A）将新鲜全血与Cy5.5近红外荧光（NIRF）探针（C15）混合，该探针在血栓成熟过程中通过活化凝血因子XIIIa的纤维蛋白交联酶作用共价结合至血栓中的纤维蛋白链上。将混合后的血液注入聚乙烯（PE）-50导管中，并静置24小时以促进血栓形成与成熟。（B）近红外荧光成像用于确...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
激光多普勒血流仪	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
手术显微镜	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
吸入式麻醉机	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
软件
NFR 控制软件	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT 控制软件
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	三维重建成像软件
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
Image J 软件	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	图像分析
设备/仪器
输注泵	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
恒温毯	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
便携式电灼器	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
脑切片模具	Ted pella, CA, USA	15003	冠状切面
PE-50 导管	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	内径 0.58 mm，外径 0.96 mm
PE-10 导管	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	内径 0.28 mm，外径 0.61 mm
30 号针头	sungshim-medical, Seoul, Korea
注射器	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
纱布	Panamedic, Cheonan, Korea
胶带	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
显微镊子	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
显微剪刀	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas 弹簧式
剪刀	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
黑色丝线缝合线	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 和 7-0
试剂
美洛昔康	Yuhan, Seoul, Korea
兽用软膏	Novartis, Basel, Swiss
10% 聚维酮碘（贝塔碘）	Firson, Cheon-an, Korea
氯化铁	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
异氟烷	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
金纳米颗粒			合成
生理盐水	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 mL