双光子显微镜监测小鼠视网膜视锥光感受器中的钙动力学

摘要

来源：Kulkarni, M. et al. 小鼠视网膜视锥光感受器轴突末梢中 Ca²⁺ 动态的成像研究。 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用双光子显微镜监测转基因小鼠视网膜视锥光感受器中钙离子动态变化的方法。视频概述了制备视网膜切片、对基于FRET的钙离子生物传感器进行成像，以及分析荧光变化以量化背景光照和光刺激条件下钙离子水平的步骤。

方案

所有涉及动物样本的操作均已被适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 切片制备（10 - 15 分钟）
   1. 提前准备好用于视网膜切片的硝酸纤维素滤膜以及用于固定切片并转移至记录室的玻璃盖玻片。使用剪刀将硝酸纤维素滤膜剪成约 10 × 5 mm 的矩形小片。使用玻璃切割刀将盖玻片切割成约 10 × 5 mm 的矩形小片。
   2. 将载玻片缓慢浸入靠近组织的细胞外溶液中。用镊子夹住HR2.1:TN-XL Ca²⁺ 生物传感器小鼠获得的视网膜切片边缘，轻轻将其神经节细胞面向上拉至载玻片上。此操作可减少组织的机械损伤和折叠。
   3. 根据具体研究问题选择视网膜的相应区域。使用弯头手术刀从此选定区域切下一小块约 1 × 2 mm 的矩形组织。擦去组织周围多余的溶液。
   4. 将滤膜放置在视网膜组织片上，使神经节细胞侧贴附于滤膜表面。立即在滤膜上滴加一滴细胞外液，使组织牢固地附着在滤膜上。
   5. 将带有滤膜的视网膜组织转移至含有新鲜细胞外溶液的切片室中。
   6. 使用安装在组织切片机上的新剃须刀片将视网膜切成 200 µm 厚的纵向切片（图 1B）。每处理一个视网膜样本均需更换刀片。
      注意： 剃须刀片必须与切片室底部表面完全对齐，以确保滤膜在整个切割过程中同时裂开，切割时会发出“咔哒”声。否则刀片可能发生弯曲并损伤切片。
   7. 仅在滤膜两端涂抹高真空润滑脂，将单个带滤膜的切片粘附到玻璃盖玻片上（图 1C）。保持视网膜下方的玻璃表面无润滑脂。
   8. 将固定在盖玻片上的切片置于孵育室（一个封闭且避光的容器，e.g., 用铝箔包裹盖子的培养皿）中，并用一滴细胞外液覆盖，在室温（RT）下以碳合气（carboxygen）环境保存。通过向一个小的水储液池中通入碳合气，使孵育室内的空气保持湿润，防止切片干燥。
   9. 在将切片转移至记录室之前，先在孵育室中静置 10 - 15 分钟（每次转移一片）。切片可在室温（~21 °C）的孵育室中保存长达 4-5 小时。

2. 双光子 Ca²⁺ 成像

1. 双光子显微镜
   1. 使用可移动物镜显微镜（MOM）型双光子显微镜。
      注意： 任何满足以下最低要求的直立式双光子显微镜均可使用：必须配备（a) 一台可调谐至约860 nm的脉冲激光器，(b至少两个同时采集的荧光通道，c）eCFP 和柠檬黄荧光蛋白（citrine）荧光的滤光片，（d）一个光源刺激器，以及（e) 软件，该软件能够以足够高的帧率记录延时图像序列，从而分辨出 Ca²⁺ 感兴趣的信号
   2. 按照制造商的说明启动双光子成像系统。严格遵守设施的激光安全指南。启动激光器并将其调谐至约860 nm。
   3. 将切片从孵育室转移至记录室，并立即开始灌流含碳酰气的细胞外液。记录室内的灌流速度维持在2 ml/min，温度维持在37 °C。
   4. 使用20倍、数值孔径（NA）0.95的水浸物镜。如有条件，可结合使用电荷耦合器件（CCD）相机与置于记录室下方的红外发光二极管（LED），以定位视网膜切片图2否则，使用双光子成像定位切片（参见2.1.5）。
   5. 切换至双光子成像以观察生物传感器表达。开启两个检测通道，用于eCFP和citrine的荧光成像。
   6. 使用控制双光子显微镜的图像采集软件扫描并选择一排视锥细胞终末用于记录（图3A设置图像采集为 128 × 16 像素图像（31.25 Hz）或类似配置。将扫描区域限制在视锥细胞终末，以避免外段光敏色素的漂白。
      注意： 对于TN-XL钙离子传感器（Ca的τ ≈ 0.6秒）²⁺ 结合，τ = ~0.2 秒 对于 Ca²⁺ 解离），建议最低帧率约为 8 Hz。
   7. 光刺激与记录
      1. 使用亚阶段全视野光刺激器执行以下步骤。
         注意： 一种全视野光刺激器的简单解决方案是使用两个带通滤光的LED（例如， “蓝色”：360 带通（BP）12，“绿色”：578 带通（BP）10，这些波长与小鼠视锥细胞的波长敏感性相匹配，同时又不与用于荧光检测的滤光片产生重叠。LED 光源通过聚光镜聚焦，从记录室底部进入图2).
      2. 打开激光器，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光（20 - 30 秒），然后再呈现光刺激（见 2.2.3）或施加药理学试剂。
      3. 开始呈现任意刺激例如， 光闪烁，如图所示 图3B、C）。对于步骤2.2.1中描述的刺激器，通过使用由定制软件控制的微处理器板，随时间调节两个LED的强度来生成刺激信号。
      4. 开始记录两个荧光通道（例如，于483 nm处用于“蓝色”
   8. Förster共振能量转移（FRET）-供体eCFP和在535 nm处的“黄色”FRET-受体，同时使用相应的图像采集软件进行采集（另见2.1.6）。例如，在光闪情况下（图 3B，C），记录至少8到10次刺激呈现（试验）。

结果

图1. 视网膜垂直切片的制备。（A） 已分离并展平的视网膜，准备进行切片。（B） 切片后固定在滤纸膜（深灰色）上的视网膜矩形片段（见A图红框）。（C） 使用封固剂将膜上固定的视网膜切片（见C图红框）固定于玻璃盖玻片上的俯视图。（D）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高真空润滑脂	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
盖玻片	R. Langenbrinck		24 x 60 mm；http://www.langenbrinck.com
载玻片	R. Langenbrinck		76 x 26 mm；http://www.langenbrinck.com
组织切片机刀片	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0.25 mm；http://www.martor.de
组织切片机	Custom-build
带网格硝酸纤维素滤膜	Merck Millipore	AABG01300	滤膜类型：0.8 µm；http://www.emdmillipore.com
基于紫外/绿光LED的全场刺激器	Custom-build
开源微处理器板	Arduino		http://www.arduino.cc
成像软件 CfNT	Custom-written		由德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所 Michael Müller 开发
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 系统局部灌流系统	ALA Scientific Instrument		配备直径为 100 μm 的灌流管尖端；http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee（钛宝石激光器）	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
可移动物镜显微镜（MOM），由德国海德堡马克斯·普朗克医学研究所 W. Denk 设计	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w 物镜	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/