双光子显微镜监测小鼠视网膜视锥细胞光感受器中的钙动力学

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 切片制备（10 - 15 分钟）
   1. 预先准备用于视网膜切片的硝酸纤维素滤膜和用于安装切片并将其转移到记录室的玻璃盖玻片。用剪刀将硝酸纤维素滤膜切成大约 10 x 5 mm 大小的矩形块。使用玻璃切割机将盖玻片切成大约 10 x 5 mm 大小的矩形块。
   2. 将载玻片缓慢浸入靠近组织的细胞外溶液中。使用一对镊子在最边缘抓住神经节细胞，轻轻地将从 HR2.1：TN-XL Ca^{2 +} 生物传感器小鼠获得的视网膜切片拉到载玻片上，神经节细胞一面朝上。这个过程减少了机械损伤和组织折叠。
   3. 选择与相应研究问题相关的视网膜区域。使用弯曲的手术刀刀片从选定的视网膜区域切出一块大约 1 x 2 毫米的矩形。擦去纸巾周围多余的溶液。
   4. 将滤膜放在视网膜片的顶部，使神经节细胞侧粘附在膜上。立即在膜上滴入一滴细胞外培养基，以将组织牢固地附着在膜上。
   5. 将膜安装的视网膜组织转移到含有新鲜细胞外溶液的切片室中。
   6. 使用连接到组织切碎机的新鲜剃须刀片将视网膜切成 200 μm 厚的垂直切片（图 1B）。更换每个视网膜片的刀片。
      注意：剃须刀片需要与切片室底部的表面完全对齐，以便整个膜同时分裂，如切割时发出的"咔哒"声所示。否则，刀片可能会弯曲并损坏切片。
   7. 通过仅在膜末端涂抹高真空润滑脂，将单个膜安装切片粘合到玻璃盖玻片上（图 1C）。保持视网膜下方的玻璃表面没有油脂。
   8. 在室温 （RT） 的碳氧气氛下，将盖玻片安装的切片在保持室中用一滴细胞外溶液覆盖 - 一个封闭且不透光的容器，例如，盖子上覆盖有铝um 箔的培养皿。通过鼓泡一个小储水器来引入碳水化合物，以保持储存室中的空气加湿;这可以防止切片变干。
   9. 让切片在保温室中静置 10 - 15 分钟，然后将它们（一个接一个）移动到记录室。切片可在室温 （~21 °C） 的保温室中保存长达 4-5 小时。

2. 双光子 Ca²⁺ 成像

1. 双光子显微镜
   1. 使用可移动物镜显微镜 （MOM） 型双光子显微镜。
      注意：任何满足以下最低要求的正置双光子显微镜都可以使用：它必须配备 （a） 可调谐至 ~860 nm 的脉冲激光器，（b） 至少两个同时采集的荧光通道，（c） 用于增强青色荧光蛋白 （eCFP） 和黄水晶荧光的滤光片，（d） 光刺激器，以及 （e） 允许以足以分辨感兴趣的 Ca²⁺ 信号的帧速率记录延时图像序列的软件。
   2. 按照制造商的指示启动双光子成像系统。严格遵守工厂的激光安全指南。启动激光并将其调谐到 ~860 nm。
   3. 将切片从保持室转移到记录室，并立即开始用碳氧化细胞外溶液灌注。在记录室中保持 2 ml/min 的灌注流速和 37 °C 的温度。
   4. 使用 20X 0.95 数值孔径 （NA） 水浸物镜。如果可用，将电荷耦合器件 （CCD） 相机与记录室下方的红外发光二极管 （LED） 结合使用，以定位视网膜切片（图 2）。否则，使用双光子成像定位切片（参见 2.1.5）。
   5. 切换到双光子成像以查看生物传感器表达。打开两个检测通道，用于 eCFP 和黄水晶的荧光成像。
   6. 使用控制双光子显微镜的图像采集软件扫描并选择一排锥形端子进行记录（图 3A）。将图像采集设置为 128 x 16 像素图像 （31.25 Hz） 或类似配置。将扫描区域限制为锥形端子，以避免在外部段漂白光色素。
      注意：对于 TN-XL 钙传感器（Ca²⁺ 结合 τ = ~0.6 秒，Ca²⁺ 解绑 τ = ~0.2 秒），建议最小帧速率为 ~8 Hz。
   7. 光刺激和记录
      1. 使用子阶段全场光刺激器执行以下步骤。
         注意：全场光刺激器的一个简单解决方案是使用两个带通过滤的 LED（例如，"蓝色"：360 带通 （BP） 12，"绿色"：578 BP 10），它们与小鼠视锥细胞的波长灵敏度相匹配，但同时不与用于荧光检测的滤光片重叠。 来自 LED 的光由冷凝器通过记录室底部聚焦（图 2）。
      2. 打开激光，让视锥细胞适应扫描激光和刺激背景光（20 - 30 秒），然后再呈现光刺激（见 2.2.3）或使用药物。
      3. 开始呈现任意刺激（例如，闪光，如图 3B、C 所示）。在步骤 2.2.1 中描述的刺激器的情况下，通过使用由定制软件控制的微处理器板随着时间的推移调制两个 LED 的强度来产生刺激。
      4. 开始记录两个荧光通道（例如，在 483 nm 处为"蓝色"
   8. Förster 共振能量转移 （FRET） 供体 eCFP 和 535 nm 处的"黄色"FRET 受体）同时使用相应的图像采集软件（另见 2.1.6）。例如，在闪光的情况下（图 3B、C），至少记录 8 - 10 次刺激呈现（试验）。

图 1.制备垂直视网膜切片。（一）分离和扁平的视网膜，准备切片。（二）切片后安装在滤纸膜（深灰色）上的矩形视网膜片（参见 A 中的红框）。（三）使用油脂固定在玻璃盖玻片上的膜安装视网膜切片的俯视图。（四）视网膜切片部分的示意图（参见 C 中的红框）。视锥体光感受器以绿色表示。V， 腹侧;D， 背侧;N， 鼻音;T， 颞叶;OS，外段;ONL， 外核层;OPL，外丛状层;INL，核内层;IPL，内丛状层;GCL，神经节细胞层。

图 2.视网膜切片的双光子成像：记录配置图。顶部：水浸物镜将扫描激光的光束（红色向下箭头）聚焦到视网膜中并收集发射的荧光（向上箭头）。当使用 CCD 相机对切片进行成像时，该镜头还可以从安装在聚光镜下方的照明 LED 收集透射的红外光。中：安装在记录室中并用细胞外溶液灌注的视网膜切片。底部：聚光镜将来自刺激 LED（以及用于 CCD 相机成像的红外 LED）的光线通过记录室的透明底部聚焦到视网膜组织中。IR LED，红外发光二极管;CCD，电荷耦合器件;BP，带通。

图 3.小鼠视锥光感受器轴突末端的光诱发电调 Ca2+ 反应。（一）左：聚焦于视网膜切片中视锥光感受器（绿色）的突触末梢（红框）的记录。右： 具有 7 个单独终端的记录区域示例。使用两个通道记录荧光：一个用于 FRET 受体黄水晶（上图;535 BP 50），另一个用于 FRET 供体 eCFP（下图;480 BP 32）。（二）在单个 ROI 中记录的黄水晶 （FA） 和 eCFP （FD） 荧光的光诱发变化。（三）锥体末端的 Ca2+ 对一系列 1 秒强光以 5 秒为间隔闪烁的响应（以比例 FA/FD}}）。ROI，感兴趣区域;BP，带通滤波器;F， 荧光强度;a.u.，任意单位;FRET，Förster 共振能量转移;eCFP，增强型青色荧光蛋白。刺激强度（以每个视锥细胞 103·P·s-1 为单位的光异构化速率）：M 和 S 视蛋白分别为 13.0 和 12.8，加上 ~10 的背景水平（= LED 关闭，激发激光扫描）。