活细胞成像观察斑马鱼视网膜再生过程中穆勒胶质细胞核的迁移

摘要

来源： Lahne, M., 等. 利用多光子显微镜进行活细胞成像的成年转基因斑马鱼视网膜外植体培养方法. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了光诱导感光细胞损伤后，琼脂糖包埋的斑马鱼视网膜外植体中穆勒胶质细胞核迁移的活细胞成像。受损感光细胞释放的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）激活穆勒胶质细胞，触发其细胞核穿过内核层和外核层迁移，以进行有丝分裂并生成神经祖细胞。所捕获的图像揭示了视网膜再生过程中细胞核迁移及祖细胞分化的动态过程。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 多光子显微镜

注意：本论文中进行的实验针对配备有红外激光器（参见材料表）、40倍高数值孔径长工作距离水浸物镜（数值孔径1.15）、检流计扫描器以及可容纳四个35 mm培养皿插件的环境培养室的多光子显微镜进行了优化。图像使用非共轭扫描探测器（R-NDD）采集。

1. 成像前，将环境培养箱平衡至5% CO₂/空气气氛。确保将空的培养皿插入支架中，以防止气体泄漏到室内。
2. 开启显微镜系统。
3. 当环境培养箱达到平衡后，将折射率匹配液滴加至40倍Apo长距离水浸物镜（数值孔径1.15）上。
   注意：使用光学性质与水相似的折射率匹配液，以避免长期成像过程中水的蒸发。
4. 将含有视网膜外植体的荧光培养皿放入培养箱中。使用明场光源，将样本置于光路中，并将背侧视网膜的中段调整至焦平面。
5. 使用GFP落射荧光光源，聚焦于gfap:nGFP阳性Müller胶质细胞核（图1A, C）。
   注意：若外植体未平整贴附或外植体下方有琼脂糖堆积，则难以聚焦到gfap:nGFP阳性细胞核，或其荧光信号微弱。
   1. 检查在同一视网膜外植体内更换区域是否可解决聚焦问题；否则更换另一个视网膜外植体。
6. 在图像采集软件中，打开“A1 MP GUI”、“TiPad”、“A1 Compact GUI”和“ND acquisition”窗口。进行双光子成像时，确保在“A1 Compact GUI”中选择“IR NDD”选项。
7. 在“setting”字段中，选择第一片二向色镜为IR-DM，并选择带通滤光片525/50以采集GFP荧光信号。
8. 在标有“A1MP GUI”的窗口中打开红外激光器。激光器需数分钟准备就绪。将激光波长设为910 nm以激发GFP荧光，并在“A1 MP GUI”窗口中点击“Auto alignment”按钮完成激光校准。
9. 在打开“A1 MP GUI”中的快门前，确保关闭或遮蔽房间及设备光源，以避免光电倍增管过曝。为降低噪声水平，应将显微镜置于暗环境中。
10. 以300 × 300像素的视野、2倍缩放和4.8 µs/像素的像素驻留时间采集图像。通过调整“A1MP GUI”中的“acquisition area”和“A1 Compact GUI”窗口中的增益，大致设定激光功率。
11. 设置z-stack
    1. 聚焦于神经节细胞层（GCL），在“ND acquisition”窗口的“z”子窗口中设定z-stack的顶部焦平面。部分gfap:nGFP阳性细胞通常位于神经节细胞层，有助于识别视网膜的基底边界（图1A, D）。
    2. 将焦平面移至外核层（ONL）水平（图1A, B），该层特征为存在荧光微弱、呈圆形且较内核层（INL）对应细胞更大的gfap:nGFP阳性细胞（图1A, C）。
    3. 将此平面设为z-stack的底部，确保整个外核层均被成像（图1A, B）。
    4. 若在成像期间出现焦平面漂移需重新调整，可在“z”子窗口中双击中间位置，将其设为“home”位置。切换至“symmetric mode defined”并点击“relative”。
    5. 将z-step大小设为0.7至1 µm。
12. z轴强度校正：
    1. 应用z轴强度校正，以补偿因组织深层成像时光散射导致的像素强度衰减。
    2. 为设置校正，打开“z-intensity correction”窗口。在“z-stack range”中选择“From ND”。
    3. 在“z-intensity correction”窗口中点击底部焦平面（本例中对应神经节细胞层），并设定激光强度（“A1MP GUI”中的“acquisition area”）和增益（A1 Compact GUI）。
    4. 点击“z-intensity correction”窗口中“z-values”旁的箭头，确认所选焦平面的设置已显示在“z-intensity correction”窗口的“device settings”下。
    5. 对中间和顶部焦平面重复上述过程，逐步增加激光功率和增益。必要时可添加更多焦平面。具体实验的激光与增益设置参见表1（对应图1 - 3）。
    6. 在“A1 MP GUI”窗口中设定“acquisition area”。为避免光漂白和噪声升高，成像开始时避免选择大于15的采集区域和高于126的增益。
       注意：由于不同显微镜系统的激光器和光电倍增管存在差异，需测试激光与增益设置，以在避免光漂白的前提下获得最佳成像条件。
    7. 在“z-intensity correction”窗口中选择“relative intensity correction”。
13. 在“ND acquisition”窗口的“timeseries”子窗口中，将时长设为8小时，间隔设为“无延迟”。然后务必点击“ND acquisition”窗口中“z-stack”子窗口的“Run z-correction”按钮，以采集三维时间序列图像。
14. 在整个图像采集过程中，维持视网膜外植体温度在27 - 29 °C。
15. 在图像采集期间，必要时重新调整激光功率和增益，以保持图像质量用于后期分析。调整时执行步骤1.11.2 - 1.11.4。
16. 若焦平面发生偏移，暂停或停止运行，并重新执行步骤1.11。
    注意：若在步骤1.12.7中已选择“relative z-correction”且已执行步骤1.11.4，则除非发生严重光漂白，否则无需重新调整功率和增益水平。

表1：图1-3所示实验中，对不同平面进行Z轴强度校正时所使用的激光功率和增益水平。

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
	激光功率	增益	激光功率	增益
顶部（视杆光感受器）	13	126	3.5	118
中部（Muller 胶质细胞）	10	126	2.8	118
底部（神经节细胞层）	8	126	2.1	118

结果

图1：视网膜多光子Z轴层扫图像的三维重建。A) 斑马鱼视网膜全层培养物在光照损伤48小时后，gfap:nGFP-阳性细胞的多光子Z轴层扫图像序列的三维重建结果。B - D) 在（A）中三维重建所显示的gfap:nGFP阳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
荧光培养皿	World Precision Instruments	FD35-100
体视显微镜	Nikon	SMZ-1B	类似型号的解剖用体视显微镜亦可使用
Sylvania 荧光灯管 OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
折射率匹配液	Cargille Lab	1803Y
配备 MaiTai 红外激光器的 Nikon A1 多光子显微镜	Nikon		功能相当的系统亦可使用
40倍高数值孔径长工作距离水浸物镜（数值孔径 1.15），配备适用于35 mm培养皿的环境培养室	Okolab		功能相当的系统亦可使用
NIS 分析软件	Nikon