利用共聚焦宏观成像技术对出生后小脑颗粒细胞迁移进行离体成像

摘要

来源：Bénard, M., 等 利用共聚焦宏观成像技术对出生后小脑颗粒细胞迁移进行离体成像。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了一种共聚焦宏观方法，用于追踪 离体 出生后大鼠脑小脑切片中颗粒细胞的迁移

方案

所有涉及动物样本的操作程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 活体中间神经元的荧光染色

1. 使用宽口玻璃截断巴斯德移液管将小脑切片转移至6孔板中（每孔最多3个切片）。吸除Hanks’平衡盐溶液（HBSS）培养基。

2. 将切片（最多3个）在5 ml荧光染料负载液（10 μM）中孵育。

3. 为避免光照，用铝箔纸包裹微孔板。在室温下以35 rpm的速度置于旋转摇床上孵育10分钟，以促进细胞标记。

4. 使用宽口玻璃截断的巴斯德移液管，将切片转移至Transwell小室的膜上（3.0 μm孔径；图1D）。用移液管吸除加样培养基。

5. 取出插入物，向孔中加入 1.9 ml 的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。放回插入物，并在切片上方加入 100 μl DMEM 以覆盖组织。

6. 将含有培养插件的培养板放入培养箱中（37 °C，5% CO₂）孵育2小时，足以观察到分子层（ML）中的颗粒细胞（GCs）。将组织平放，使其贴附在插件膜上（图1E）。确保切片不会干燥。

2. 离体共聚焦宏观成像

1. 将无塑料盖的培养板放入与共聚焦宏显微镜支架相连的培养箱中。将玻璃盖置于宏显微镜的板插件上。保持腔室温度为 37.0 °C ± 0.5 °C，并通过板插件向组织切片持续供给气体（95% O₂, 5% CO₂），以维持 pH 恒定。在开始延时成像实验前，再等待 2 小时。

2. 为观察组织切片中颗粒细胞的迁移，使用激光二极管通过配备X2干式物镜（工作距离：39 mm，直径：58 mm，NA = 0.234）的共聚焦激光扫描宏显微镜，以488 nm波长的光照射样本，并检测500至530 nm范围内的荧光发射。

1. 为精细分辨生发中心（GCs）的运动，以额外1.5至2.0倍的光学变焦倍数采集图像。每30分钟采集一次生发中心在单个焦平面或沿z轴最多10个不同焦平面的图像，持续时间最长可达12小时。

3. 必要时，移去玻璃盖，用10 μl移液器向DMEM中加入少量（1-10 μl）生物激活剂或抑制剂，以研究它们对颗粒细胞迁移的影响。

3. 细胞示踪

1. 对于影片的每一时间点，使用 ImageJ 中的 ecart-type 模式进行 z-stack 投影。调节连续图像的对比度和亮度水平，以方便识别和追踪标记的颗粒细胞（GCs）。在参考快照（t = 0 时）上手动标定每个位置。

1. 在“Analyze Particle”菜单中使用“Manual tracking”插件，通过在时间序列中单击每个细胞体的重心来确定其轨迹。将原始追踪数据导出至电子表格中。

2. 使用一个智能的自制程序对从 ImageJ 导出的原始追踪数据进行重新整理，该程序能够识别每个细胞及其相关位置。利用该程序，计算每个细胞的总迁移距离和平均迁移速度。在适当的筛选条件下，使用同一程序对对照组和处理组中细胞迁移特征进行分类和比较。

结果

图1：离体培养P10小脑切片。（A）P10大鼠分离的小脑。比例尺 = 6 mm。（B）通过体视显微镜观察的活体180 μm厚小脑切片的显微图像。比例尺 = 3 mm。（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基与营养混合物 F-12）	Sigma-Aldrich	D8437
Cell Tracker Green CMFDA	Invitrogen	C2925
聚酯 Transwell-Clear 小室	Corning	3452
6 孔细胞培养板	Corning	3516
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
旋涡摇床，SSL3	Stuart
CO₂ 培养箱，Hera Cell 150	Thermo Scientific
共聚焦大视场显微镜，TCS LSI	Leica Microsystems
CO₂ 控制器	PeCon
Hank's 平衡盐溶液 10 倍浓缩液	Sigma-Aldrich	H1641
可调体积移液器（0.5–10 μL）	Eppendorf	4910 000.018
温度控制器	PeCon