小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

摘要

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了使用共聚焦激光扫描显微镜对转基因小鼠脑组织中的神经干细胞（NSCs）进行延时成像的过程。NSCs在细胞周期的G1期呈现红色荧光，而在其他细胞周期阶段不产生荧光。将贴壁生长的NSC培养物置于成像腔室中，设定成像参数后，在所需的时间范围内以固定间隔连续采集图像。

方案

1. 培养与视频显微镜观察前的基本准备

1. 使用玻璃底培养板或 µ-板进行共聚焦视频显微镜观察。对于每孔 1 - 5 × 10³ 个细胞，使用 96 孔板；对于每孔超过 5 × 10³ 个细胞，使用 24 孔板。
2. 在开始实验前至少一天，为贴壁单层培养物制备无菌的多聚-L-赖氨酸（Poly-D-lysine, PDL）包被板。加入足量 PDL（10 µg/ml，溶于蒸馏水或 dH₂O）以覆盖每个孔的底部，并在 37 °C 下孵育过夜（O/N）。移除 PDL 溶液后，用 dH₂O 洗涤三次，然后在超净台中于层流条件下干燥至少 2 小时。若不立即使用，将包被好的板储存于 -20 °C。
3. 通过将神经干细胞（NSC）基础培养基与 NSC 增殖添加剂按 9:1 比例混合（参见材料表），并加入 2 µg/ml 肝素、20 ng/ml 纯化人重组表皮生长因子（EGF）和 10 ng/ml 人重组成纤维细胞生长因子 2（FGF-2），配制培养基。使用前在水浴中将培养基预热至 37 °C。
4. 为进行侧脑室下区（subventricular zone, SVZ）组织解离，配制木瓜蛋白酶溶液：在 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）中加入 1 mg/ml 木瓜蛋白酶（15 UI/ml）、0.2 mg/ml L-半胱氨酸、0.2 mg/ml 乙二胺四乙酸（EDTA），以及在磷酸盐....

结果

图1：使用FUCCI-Red小鼠对细胞周期进行活体分析。 （A）FUCCI-Red细胞周期的示意图，其中细胞在G₁期呈现红色荧光，在S-G₂/M期无色。（B）SVZ细胞上FUCCI-Red荧光的FACS图示。（C, D）通过视频显微镜观察从年轻（C）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔无涂层玻璃底培养板	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
96孔µ-板	Ibidi	89626
聚-D-赖氨酸	Millipore	A003E
NeuroCult NSC 基础培养基	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC 增殖补充剂	STEMCELL Technologies	5701
肝素	STEMCELL Technologies	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-半胱氨酸	Sigma	C-7352
0.5 M EDTA，pH 8.0	Promega	V4231
DNase I	Sigma	D5025-15KU
胰蛋白酶抑制剂 II 型	Sigma	T9128	卵黏蛋白
DMEM:F12 培养基	Life Technologies	31330-038
20 µm 滤膜	BD Medimachine Filcon	340622
Eppendorf 微量离心管 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	牛血清白蛋白溶液
CD24 藻红蛋白-氰基7偶联物 [PC7]	Life Technologies	A14776	小鼠 IgM；克隆 MMA。1:50
CD15/LeX 异硫氰酸荧光素 [FITC] 偶联抗体	BD Biosciences	332778	大鼠 IgG2b；克隆 M1/69。1:50
小鼠抗人 LeX 抗体	BD Pharmingen	559045	小鼠 IgM；克隆 MAM。1:50
Alexa647 偶联 EGF 配体	Life Technologies	E35351	1:200；Ax647 偶联 EGF 配体
CompBeads	BD Biosciences	644204
MACS LS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	分离柱
抗小鼠 IgM 磁珠	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405
INFLUX 细胞分选仪	BD Biosciences		FACS 分选仪
连接倒置 ECLIPSE Ti 显微镜的尼康 A1R 共聚焦激光扫描显微镜系统	Nikon Corp.		共聚焦激光扫描显微镜
NIS-Elements AR.4.13.01 64位软件	Nikon Corp.		NIS-Elements 软件
Plan Apo VC 20倍 DIC 物镜（NA：0.75）	Nikon Corp.
ECLIPSE Ti 恒温培养室	Nikon Corp.		恒温培养室
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ashland, OR
FUCCI 小鼠	RIKEN 生物资源中心，日本