使用共聚焦显微镜对小鼠神经干细胞分裂进行延时成像

摘要

资料来源：Daynac， M.， et.al 的来自成年小鼠脑室下区的神经干细胞和祖细胞的细胞分选及其细胞周期动力学的实时成像。J. Vis. Exp. （2015）

该视频演示了使用共聚焦激光扫描显微镜对转基因小鼠大脑的神经干细胞（NSC）进行延时成像。NSC 在 G1 期发出红色荧光，在其他细胞周期期不发荧光。将粘附的 NSC 培养物置于成像室中，设置成像参数，并在所需的持续时间内定期捕获图像。

方案

1. 培养和视频显微镜检查前的基本设置

1. 使用玻璃底培养板或 μ 板进行共聚焦视频显微镜检查。对于 1 - 5 x 10³ 个细胞/孔，使用 96 孔板，对于超过 5 x 10^{个 3} 细胞/孔，使用 24 孔板。
2. 至少在实验开始前一天，准备无菌多聚-D-赖氨酸 （PDL） 包被板，用于贴壁单层培养。加入足够的 PDL（10 μg/ml 蒸馏水或 dH₂O）以包被每个孔的底部，并在 37 °C 下孵育过夜 （O/N）。取出 PDL 溶液并用 dH₂O 冲洗 3 次，然后让板在层流下在通风橱中干燥至少 2 小时。如果不立即使用，请将涂层板储存在 -20 °C。
3. 通过将神经干细胞 （NSC） 基础培养基和 NSC 增殖补充剂以 9：1 的比例混合来制备培养基（参见材料表）以及 2 μg/ml 肝素、20 ng/ml 纯化的人重组表皮生长因子 （EGF） 和 10 ng/ml 人重组成纤维细胞生长因子 2 （FGF-2）。使用前，将培养基在水浴中加热至 37 °C。
4. 对于脑室下区 （SVZ） 解离，制备木瓜蛋白酶溶液：1 mg/ml 木瓜蛋白酶 （15 UI/ml） 在 Earl's 平衡盐溶液 （EBSS） 中，含有 0.2 mg/ml L-半胱氨酸、0.2 mg/ml 乙二胺四乙酸 （EDTA） 和 0.01 mg/ml DNase I 在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。通过将溶液通过 0.2 μm 过滤器对溶液进行消毒。使用前在 37 °C 下平衡溶液。
5. 为了终止酶促反应，制备蛋白酶抑制剂溶液 （Ovomucoid）：dulbecco 改良的 eagle 培养基 （DMEM）：含有 0.7 mg/ml II 型胰蛋白酶抑制剂的 F12 培养基。使用 0.2 μm 过滤器过滤溶液。
6. 准备 PBS 0.6% 葡萄糖溶液以收集大脑和 PBS 0.15% 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液，用于洗涤步骤和抗体染色。
7. 准备解剖工具：剪刀、解剖和打结镊子以及手术刀。将它们浸泡在 70% 乙醇中。

2. 成年小鼠大脑和 SVZ 显微解剖

1. 的收获 牺牲成年荧光泛素化细胞周期指示剂 （FUCCI） 小鼠（2 至 3 个月大和/或 12 个月大用于衰老研究），根据适当的机构指南进行颈椎脱位。
2. 用 70% 乙醇喷洒鼠标，然后用锋利的剪刀剪掉头部。
3. 沿着头皮切开，露出头骨。
4. 使用一把小剪刀从颅骨底部开始向嗅球方向进行纵向中线切割。确保避免用剪刀刀片损坏底层大脑。用弯曲的镊子去除颅骨的上部开口部分，露出大脑。
5. 将大脑收集在含有 0.6% 葡萄糖的 PBS 中的 15 毫米培养皿中。
6. 解剖掉嗅球。将大脑放在其背面，并使用手术刀通过视交叉制作冠状切片。
7. 在解剖显微镜下，将大脑切片的喙部定位，切开的冠状面朝上朝向实验者。
8. 要解剖 SVZ，请用细弯曲的镊子去除隔膜，然后将细镊子的一个尖端插入紧邻脑室的纹状体中，并将 SVZ 与周围组织分离。将解剖的 SVZ 放入含有 1 ml PBS-0.6% 葡萄糖的培养皿中。

3. SVZ 组织解离

1. 将解剖的 SVZ 在培养皿中切碎，直到没有大块残留。
2. 将切碎的组织与 PBS-0.6% 葡萄糖一起转移到 15 ml 试管中，并以 200 x g 离心 5 分钟。
3. 弃去上清液，加入 1 ml 预热的木瓜蛋白酶（1 mg/ml，在步骤 1.4 中制备），补充有 0.01 mg/ml DNase I。在 37 °C 的水浴中孵育 10 分钟。每只小鼠使用 1 ml 木瓜蛋白酶。
4. 以 200 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
5. 加入 1 ml 预热的卵类粘蛋白（0.7 mg/ml，在步骤 1.5 中制备）以终止木瓜蛋白酶活性。通过 p1000 微量移液器吸头轻轻上下吹打 20 次，将切碎的组织进一步机械解离成单细胞悬液。避免气泡。
6. 将细胞悬液通过新的 15 ml 试管中的无菌 20 μm 过滤器。确保用 PBS 0.15% BSA 清洗细胞过滤器，以避免细胞丢失。
7. 以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。将细胞重悬于 100 μl 含有 0.15% BSA 的 PBS 中。

4. 用于细胞分选的免疫荧光染色

对于使用 FUCCI-Red 小鼠的细胞分选（图 1A），使用以下抗体：CD24 藻红蛋白-花青素 7 偶联物 [PC7];CD15/LeX 异硫氰酸荧光素 [FITC] 偶联和 Ax647 偶联 EGF 配体。

注意：LeX ⁺ EGFR ⁺ 细胞和 EGFR ⁺ 细胞在成人 SVZ 中不丰富：分别为 ≈ 600 和 1500 个细胞/小鼠。我们建议混合 2 到 3 只小鼠的 SVZ 细胞以获得足够的材料。请勿在同一天与超过 12 只小鼠一起工作，以免细胞分选持续时间超过 3 小时。请记住，在同一天处理过多的小鼠会导致细胞分选持续时间增加，可能导致细胞死亡和/或细胞分化增加。

1. 在每只小鼠 100 μl PBS 0.15% BSA 中进行 FACS 染色（或一组 2 至 3 只小鼠在 200 μl 中进行 FACS 染色以获得最佳染色）。
2. 准备对照管。根据制造商的方案，使用补偿珠准备单色对照管。选择一部分细胞（从一只小鼠中提取的 1/10 细胞就足够了）并将其分成 4 个试管，以制备 1 个阴性对照管（未标记的细胞）和 3 个荧光减一 （FMO） 对照管。将细胞重悬于每管 200 μl PBS 0.15% BSA 中。
   提示：对于 LeX-FITC FMO 对照，用 CD24-PC7 （1：50） 和 Ax647 偶联的 EGF 配体 （1：200） 标记细胞;对于 CD24-PC7 FMO 对照，用 CD15/LeX-FITC （1：50） 和 Ax647 偶联的 EGF 配体 （1：200） 标记细胞，对于 Ax647 偶联的 EGF 配体 FMO 对照，用 CD15/LeX-FITC （1：50） 和 CD24-PC7 （1：50） 标记细胞。
3. 对于用于细胞分选的试管，在 PBS 0.15% BSA 中使用指定稀释度的以下抗体：CD24-PC7 （1：50）、CD15/LeX-FITC （1：50） 和 Ax647 偶联的 EGF 配体 （1：200）。
4. 在 4 °C 下避光孵育 20 分钟。用 1 ml PBS 0.15% BSA 洗涤并以 200 x g 离心 10 分钟。将细胞重悬于每个大脑 200 μl PBS 0.15% BSA 中。将细胞分选管放在冰上，并立即进行细胞分选。
5. 如果使用 FUCCI-Green 小鼠，请在细胞分选前使用分离柱分离 LeX 阳性和 LeX 阴性组分，因为 LeX-FITC 抗体与 FUCCI-green 荧光具有相同的发射波长（图 2A、B）。<>
6. 首先，在 4 °C 下，在 100 μl PBS 0.15% BSA 中，用小鼠抗人 LeX 抗体 （1：50） 标记细胞 15 分钟。
7. 用 1 ml PBS 0.15% BSA 洗涤细胞，以 200 x g 离心 10 分钟，然后用抗小鼠 IgM 微珠 （1：10） 在 4 °C 下避光标记细胞 15 分钟。
8. 用 1 ml PBS 0.15% BSA 洗涤细胞，并以 200 x g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 500 μl PBS 0.15% BSA 中，并将细胞倒入磁场中的分离柱，如图 2C 所示。用 1 ml PBS 0.15% BSA 洗涤色谱柱以获得 LeX 阴性馏分。
9. 为了获得 LeX 阳性组分，从磁场中取出分离柱，并用 2 ml PBS 0.15% BSA 洗脱细胞。
10. 如 4.2 所示，进行 CD24-PC7 和 Ax647 偶联的 EGF 配体染色。

5. 细胞分选

注意：细胞在 FACS 分选仪上以 40 Psi 和 86 μm 喷嘴分选。使用以下滤光片组收集荧光：520/35nm （FITC）、575/26nm （PE）、670/20nm （Ax647） 和 740LP （PC7）。补偿是必要的，以防止假阳性信号，因为在 FUCCI-red 荧光和 PC7 染料的发射光谱之间发现重叠。

1. 在细胞分选之前，立即添加活性染料以区分活细胞和死细胞。我们使用终浓度为 2 μg/ml 的 Hoechst （HO）（参见材料表）。通过 FACS 分选仪运行阴性对照管（未标记的细胞），并使用侧向散射 （SSC） 和前向散射 （FSC） 参数选择细胞（图 3A）.
   注意：通过仅设门 HO 负分数（图 3A）来排除死细胞，然后通过选择脉冲宽度负分数来排除双峰（图 3A）。
2. 运行步骤 4.2 中准备的单色对照，并在必要时调整光电倍增管 （PMT） 电压（即负细胞群过高和/或阳性细胞不合格）。在软件的补偿窗口中执行颜色补偿。
3. 运行步骤 4.2 中准备的 FMO 对照（LeX-FITC FMO 对照、CD24-PC7 FMO 控制和 Ax647 偶联的 EGF 配体 FMO 对照）并绘制分选门（图 3）。将细胞直接分选到 1.5 ml 微管中的 100 μl 培养基中。

6. 显微镜用细胞的制备

将

1. 新鲜分选的细胞以 1 - 3 x 10³ 个细胞/孔的密度铺板在涂有 300 μl 培养基的 Poly-D-Lysine 包被的 96 孔μ板上。
2. 在视频显微镜检查之前，将培养板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育至少 1 小时，以允许细胞粘附。

7. 显微镜设置和图像采集

1. 在连接到倒置恒温室的共聚焦激光扫描显微镜系统上，在 37 °C、5% CO₂ 气氛下，使用 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（NA：0.75）进行实时成像。
2. 将 96 孔 μ 板置于预热和平衡的恒温腔室内，并用恒温盖更换盖子。
3. 打开 NIS-Elements 软件，然后单击菜单栏中的"采集/采集控制/ND 采集"以选择延时选项（长度、载物台位置、共聚焦 z 截面,...），"采集/采集控制/Ti Pad"选择物镜，然后单击"采集/采集控制/A1plus 设置"以选择菜单栏中每种荧光的 PMT 水平。选择一个文件夹以保存数据文件。
4. 使用 ND 采集窗口，将每个孔的中心设置为载物台位置，并选择大图像选项为 7 x 7 mm²。这将在每个井的中心周围创建一个马赛克图像。将大型马赛克图像的重叠设置为 5%。每 20 分钟拍摄一次照片，持续 24 小时。在 Ti Pad 窗口中选择 Plan Apo VC 20x DIC 物镜 （NA： 0.75）。
5. 在 A1plus 设置窗口中，使用高速共振扫描仪以 512 x 512 像素格式采集图像，分辨率为 1.26 μm/像素。使用明场可视化细胞形状。对于 FUCCI-Red 小鼠，在 561 nm 处激发红色荧光并使用 595/50 nm 滤光片收集。对于 FUCCI-Green 小鼠，在 488 nm 处激发绿色荧光，并使用 530/40 nm 滤光片收集。确定每个波长的最佳 PMT 电平、偏移和激光功率。
   注意：我们建议对明场通道使用自动对焦功能，以允许软件在每次采集前在每个载物台位置进行自动对焦。提示：使用 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（NA：0.75）无需油即可获得出色的分辨率。根据所需的光学分辨率，可以使用其他物镜。
6. 在 ND 采集窗口中选择"Run now"按钮开始采集。

结果

图 1：使用 FUCCI-Red 小鼠对细胞周期进行实时分析。（A） FUCCI-Red 细胞周期示意图，其中细胞在 G 期间发出红色荧光₁ 相，S-G₂/M 相无色。（B） FUCCI-Red 荧光在 SVZ 细胞上的 FACS 表示。（C、D）使用从年轻 （C） 和中年 （D） FUCCI-Red 小鼠中分选的 LeX⁺EGFR⁺ 和 EGFR⁺ 细胞进行视频显微镜...

材料