小鼠神经干细胞分裂的共聚焦显微镜延时成像

摘要

来源：Daynac, M., et. al．从小鼠成年脑室下区分离神经干细胞与前体细胞及其细胞周期动态的活体成像．J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了使用共聚焦激光扫描显微镜对转基因小鼠脑组织中的神经干细胞（NSCs）进行延时成像的过程。NSCs在细胞周期的G1期呈现红色荧光，而在其他细胞周期阶段不产生荧光。将贴壁生长的NSC培养物置于成像腔室中，设定成像参数后，在所需的时间范围内以固定间隔连续采集图像。

方案

1. 培养与视频显微镜观察前的基本准备

1. 使用玻璃底培养板或 µ-板进行共聚焦视频显微镜观察。对于每孔 1 - 5 × 10³ 个细胞，使用 96 孔板；对于每孔超过 5 × 10³ 个细胞，使用 24 孔板。
2. 在开始实验前至少一天，为贴壁单层培养物制备无菌的多聚-L-赖氨酸（Poly-D-lysine, PDL）包被板。加入足量 PDL（10 µg/ml，溶于蒸馏水或 dH₂O）以覆盖每个孔的底部，并在 37 °C 下孵育过夜（O/N）。移除 PDL 溶液后，用 dH₂O 洗涤三次，然后在超净台中于层流条件下干燥至少 2 小时。若不立即使用，将包被好的板储存于 -20 °C。
3. 通过将神经干细胞（NSC）基础培养基与 NSC 增殖添加剂按 9:1 比例混合（参见材料表），并加入 2 µg/ml 肝素、20 ng/ml 纯化人重组表皮生长因子（EGF）和 10 ng/ml 人重组成纤维细胞生长因子 2（FGF-2），配制培养基。使用前在水浴中将培养基预热至 37 °C。
4. 为进行侧脑室下区（subventricular zone, SVZ）组织解离，配制木瓜蛋白酶溶液：在 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）中加入 1 mg/ml 木瓜蛋白酶（15 UI/ml）、0.2 mg/ml L-半胱氨酸、0.2 mg/ml 乙二胺四乙酸（EDTA），以及在磷酸盐缓冲液（PBS）中含 0.01 mg/ml DNase I。通过 0.2 µm 滤器过滤除菌。使用前将溶液平衡至 37 °C。
5. 为终止酶反应，配制蛋白酶抑制剂溶液（卵黏蛋白，Ovomucoid）：含 0.7 mg/ml II 型胰蛋白酶抑制剂的 DMEM:F12 培养基。使用 0.2 µm 滤器过滤该溶液。
6. 配制含 0.6% 葡萄糖的 PBS 溶液用于脑组织收集，配制含 0.15% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液用于洗涤步骤及抗体染色。
7. 准备解剖工具：剪刀、解剖镊、结扎镊和手术刀。将其浸泡于 70% 乙醇中消毒。

2. 成年小鼠脑组织的采集与脑室下区显微解剖

1. 处死成年荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）小鼠（2至3月龄和/或用于衰老研究的12月龄小鼠），操作需依照相关机构指南进行颈椎脱位。
2. 用70%乙醇喷洒小鼠，然后用锋利的剪刀剪下头部。
3. 沿头皮做切口以暴露颅骨。
4. 使用小型剪刀从颅底开始沿中线向嗅球方向进行纵向剪切。注意避免剪刀刀片损伤下方的脑组织。用弯头镊子移除颅骨上方敞开的部分，以暴露脑组织。
5. 在含有0.6%葡萄糖的PBS中，将脑组织收集至15 mm的培养皿中。
6. 剥离嗅球。将脑组织置于背侧表面，使用解剖刀在视交叉处进行冠状切面切割。
7. 在解剖显微镜下，将脑切片的吻侧部分放置，使切割的冠状面朝上，面向实验者。
8. 使用精细弯头镊子去除隔区，然后将精细镊子的一端插入紧邻脑室的纹状体部位，将脑室下区（SVZ）从周围组织中分离。将分离出的SVZ组织置于含有1 ml PBS-0.6%葡萄糖溶液的培养皿中。

3. SVZ 组织解离

1. 在培养皿中将分离的SVZ组织切碎，直至无大块组织残留。
2. 将切碎的组织连同PBS-0.6%葡萄糖溶液转移至15 ml离心管中，在200 × g条件下离心5分钟。
3. 弃去上清液，加入1 ml预热的木瓜蛋白酶溶液（1 mg/ml，按步骤1.4配制），并添加0.01 mg/ml DNase I。于37 °C水浴中孵育10分钟。每只小鼠使用1 ml木瓜蛋白酶溶液。
4. 在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
5. 加入1 ml预热的卵黏蛋白溶液（0.7 mg/ml，按步骤1.5配制）以终止木瓜蛋白酶活性。通过使用p1000移液器枪头轻柔吹打20次，将组织进一步机械解离成单细胞悬液。避免产生气泡。
6. 将细胞悬液通过一个新的无菌20 µm滤膜过滤器过滤至新的15 ml离心管中。确保用含0.15% BSA的PBS冲洗滤膜，以防止细胞损失。
7. 在200 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。将细胞重悬于100 µl含0.15% BSA的PBS中。

4. 用于细胞分选的免疫荧光染色

使用FUCCI-红色小鼠进行细胞分选时（图1A），请使用以下抗体：CD24藻红蛋白-花青素7偶联物[PC7]；CD15/LeX异硫氰酸荧光素[FITC]偶联物以及Ax647偶联的EGF配体。

注意： LeX⁺EGFR⁺ 细胞和EGFR⁺ 成年SVZ中的细胞并不丰富： ≈ 600 和 1500 个细胞/小鼠。建议合并 2 至 3 只小鼠的 SVZ 细胞以获得足够的材料。同一天处理的小鼠数量不要超过 12 只，以确保细胞分选时间不超过 3 小时。请注意，同一天处理过多小鼠将导致细胞分选时间延长，可能引起细胞死亡增加和/或细胞分化。

1. 每只小鼠使用 100 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 进行 FACS 染色（若为 2 至 3 只小鼠的样本组合，使用 200 µl 以获得最佳染色效果）。
2. 准备对照管。根据制造商说明书，使用补偿微珠制备单色对照管。取部分细胞（一只小鼠提取细胞的 1/10 即可），分装至 4 个管中，用于制备 1 个阴性对照管（未标记细胞）和 3 个荧光减一（FMO）对照管。每管用 200 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 重悬细胞。
   提示：LeX-FITC FMO 对照中，使用 CD24-PC7（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）对细胞进行标记；CD24-PC7 FMO 对照中，使用 CD15/LeX-FITC（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）进行标记；Ax647 标记的 EGF 配体 FMO 对照中，使用 CD15/LeX-FITC（1:50）和 CD24-PC7（1:50）进行标记。
3. 对于用于细胞分选的管，使用以下抗体以指定稀释比例溶于含 0.15% BSA 的 PBS 中：CD24-PC7（1:50）、CD15/LeX-FITC（1:50）和 Ax647 标记的 EGF 配体（1:200）。
4. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。加入 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤，200 × g 离心 10 分钟。每只小鼠脑组织来源的细胞用 200 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 重悬。将用于细胞分选的管保持在冰上，并立即进行细胞分选。
5. 若使用 FUCCI-Green 小鼠，在细胞分选前应使用分离柱分离 LeX 阳性和 LeX 阴性组分，因为 LeX-FITC 抗体的发射波长与 FUCCI-green 荧光相同（图 2A、B）。
   1. 首先，在 100 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 中，于 4 °C 避光孵育 15 分钟，使用小鼠抗人 LeX 抗体（1:50）对细胞进行标记。
   2. 用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤细胞，200 × g 离心 10 分钟，然后在 4 °C 避光条件下，使用抗小鼠 IgM 磁珠（1:10）标记细胞 15 分钟。
   3. 用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤细胞，200 × g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 500 µl 含 0.15% BSA 的 PBS 中，并按照 图 2C 所示示意图，将细胞通过置于磁场中的分离柱。用 1 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗涤柱子，收集 LeX 阴性组分。
   4. 为获得 LeX 阳性组分，将分离柱从磁场中取出，用 2 ml 含 0.15% BSA 的 PBS 洗脱细胞。
   5. 按照步骤 4.2 所述，进行 CD24-PC7 和 Ax647 标记的 EGF 配体染色。

5. 细胞分选

注意：细胞使用FACS分选仪进行分选，压力为40 Psi，喷嘴直径为86 µm。荧光信号采集使用的滤光片组如下：520/35 nm（FITC）、575/26 nm（PE）、670/20 nm（Ax647）和740LP（PC7）。由于FUCCI-red荧光与PC7染料的发射光谱之间存在重叠，必须进行补偿以避免出现假阳性信号。

1. 细胞分选前，立即加入活体染料以区分活细胞与死细胞。我们使用终浓度为 2 µg/ml 的 Hoechst（HO）染料（参见材料表）。将阴性对照管（未标记细胞）上机进行 FACS 分选，利用侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）参数选择细胞（图 3A）。
   注意：通过圈选 HO 阴性细胞群排除死细胞（图 3A），随后通过选择脉冲宽度阴性细胞群排除双联体（图 3A）。
2. 运行步骤 4.2 中制备的单色对照样本，必要时调整光电倍增管（PMT）电压（例如阴性群体过高和/或阳性细胞超出量程）。在软件的补偿窗口中进行荧光补偿校正。
3. 运行步骤 4.2 中制备的 FMO 对照样本（LeX-FITC FMO 对照、CD24-PC7 FMO 对照以及 Ax647 标记的 EGF 配体 FMO 对照），设定分选门（图 3），并将细胞直接分选至含有 100 µl 培养基的 1.5 ml 微量离心管中。

6. 显微镜观察用细胞的制备

1. 将 freshly sorted 的细胞以每孔 1 - 3 × 10³ 个细胞的密度接种于含 300 µl 培养基的 Poly-D-Lysine 包被的 96 孔 µ-Plate 中。
2. 进行视频显微镜观察前，将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育至少 1 小时，以促进细胞贴壁。

7. 显微镜设置与图像采集

1. 使用配备倒置恒温培养室（37℃）的共聚焦激光扫描显微镜系统，结合 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（NA：0.75）进行活细胞成像 °C，置于5% CO₂条件下₂ 大气
2. 将96孔板 µ-将培养皿放入预热并平衡好的恒温腔室内，并用恒温盖替换原有盖子。
3. 打开 NIS-Elements 软件，点击菜单栏中的“采集/采集控制/ND 采集”以选择延时成像的选项（时长、载物台位置、共聚焦 z 轴切片、…），在菜单栏中选择“采集/采集控制/Ti 垫”以设定物镜，选择“采集/采集控制/A1plus 设置”以设定每种荧光的 PMT 增益水平。选择用于保存数据文件的文件夹。
4. 使用ND采集窗口，将每个孔的中心设为载物台位置，并选择大图像选项为7 x 7 mm²这将在每个孔的中心周围生成一幅马赛克图像。将大马赛克图像的重叠率设置为5%。每20分钟拍摄一次，持续24小时。在Ti Pad窗口中选择Plan Apo VC 20x DIC物镜（NA：0.75）。
5. 在 A1plus 设置窗口中，使用高速共振扫描仪以 512 × 512 像素的格式采集图像，分辨率为 1.26 µm/像素。使用明场观察细胞形态。对于FUCCI-红小鼠，以561 nm激发红荧光，并使用595/50 nm滤光片采集信号。对于FUCCI-绿小鼠，以488 nm激发绿荧光，并使用530/40 nm滤光片采集信号。针对每个波长，确定最佳的PMT增益、偏移量和激光功率。
   注意建议在明场通道中使用自动对焦功能，以便软件在每次采集前于每个成像位置自动对焦。提示：选用 Plan Apo VC 20x DIC 物镜（NA：0.75），因其具有优异的分辨率且无需使用镜油。可根据所需的光学分辨率选择其他物镜。
6. 在 ND 采集窗口中选择“立即运行”按钮以开始采集。

结果

图1：使用FUCCI-Red小鼠对细胞周期进行活体分析。 （A）FUCCI-Red细胞周期的示意图，其中细胞在G₁期呈现红色荧光，在S-G₂/M期无色。（B）SVZ细胞上FUCCI-Red荧光的FACS图示。（C, D）通过视频显微镜观察从年轻（C）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔无涂层玻璃底培养板	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
96孔µ-板	Ibidi	89626
聚-D-赖氨酸	Millipore	A003E
NeuroCult NSC 基础培养基	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC 增殖补充剂	STEMCELL Technologies	5701
肝素	STEMCELL Technologies	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-半胱氨酸	Sigma	C-7352
0.5 M EDTA，pH 8.0	Promega	V4231
DNase I	Sigma	D5025-15KU
胰蛋白酶抑制剂 II 型	Sigma	T9128	卵黏蛋白
DMEM:F12 培养基	Life Technologies	31330-038
20 µm 滤膜	BD Medimachine Filcon	340622
Eppendorf 微量离心管 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	牛血清白蛋白溶液
CD24 藻红蛋白-氰基7偶联物 [PC7]	Life Technologies	A14776	小鼠 IgM；克隆 MMA。1:50
CD15/LeX 异硫氰酸荧光素 [FITC] 偶联抗体	BD Biosciences	332778	大鼠 IgG2b；克隆 M1/69。1:50
小鼠抗人 LeX 抗体	BD Pharmingen	559045	小鼠 IgM；克隆 MAM。1:50
Alexa647 偶联 EGF 配体	Life Technologies	E35351	1:200；Ax647 偶联 EGF 配体
CompBeads	BD Biosciences	644204
MACS LS 分离柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	分离柱
抗小鼠 IgM 磁珠	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405
INFLUX 细胞分选仪	BD Biosciences		FACS 分选仪
连接倒置 ECLIPSE Ti 显微镜的尼康 A1R 共聚焦激光扫描显微镜系统	Nikon Corp.		共聚焦激光扫描显微镜
NIS-Elements AR.4.13.01 64位软件	Nikon Corp.		NIS-Elements 软件
Plan Apo VC 20倍 DIC 物镜（NA：0.75）	Nikon Corp.
ECLIPSE Ti 恒温培养室	Nikon Corp.		恒温培养室
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ashland, OR
FUCCI 小鼠	RIKEN 生物资源中心，日本