自由活动小鼠中的实时微型内窥镜钙成像

摘要

来源：Lee, H. et. al., 在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了在小鼠体内使用梯度折射率（GRIN）透镜和微型显微镜进行活体钙成像的技术。该实验装置结合了无摩擦移动笼系统中的头部固定，可刺激神经元并触发钙离子内流。GRIN透镜能够捕捉大脑中的钙信号，从而实现神经元活动的实时可视化。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意：本方案包含六个主要步骤：病毒注射手术、梯度折射率（GRIN）透镜植入手术、GRIN透镜植入效果验证、基板固定、在行为测试期间对GCaMP（绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白（CaM）与肌球蛋白轻链激酶来源的肽段M13的融合蛋白）信号进行光学记录，以及数据处理（图1A）。除手术步骤外，其余均使用商业软件套件（Inscopix）完成。

1. 立体定位手术——腺相关病毒（AAV）注射
注意：本手术所用小鼠品系为 C57BL6/J。手术过程中，小鼠身体需覆盖无菌手术单，所有操作步骤均需佩戴无菌手套进行。通常情况下，不建议在同一天进行多台手术。然而，若必须在同一天对多只小鼠实施相同手术，则每只小鼠应使用独立的一套经高压灭菌的手术器械，并在各只小鼠之间使用70%乙醇对手术器械进行消毒。为在手术过程中维持小鼠体温，将小鼠固定于立体定位仪后，需用定制的手术保温毯覆盖小鼠身体。

1. 使用70%乙醇对所有必需的手术器械进行消毒，并准备好Hamilton注射器和玻璃移液管。用蒸馏水填充玻璃移液管。
   注意： 本方案中使用的所有手术器械均已进行高压灭菌。由于GRIN透镜和颅骨螺钉不能高压灭菌，因此使用70%乙醇作为消毒剂以防止炎症。尽管尚未尝试，但也可使用其他形式的灭菌方法....

结果

图1：LA区体内微内窥镜钙成像立体定位手术的示意图与流程图。 （A）LA区体内微内窥镜钙成像的示意图流程。（B）显示病毒注射和GRIN透镜植入手术开颅位点二维坐标的显微图像。两枚颅骨螺钉与透镜构成一个等边三角形。（C）病毒注射位点与植入式GRIN透镜之间相对位置的示意图，以及“值A”计算方法的图解说明。（D）手术最后步骤中从颅骨表面至头固定板的水泥层.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26G针头	BD	302002	手术
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	手术
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	定制		外科手术
丙烯酸牙科水泥（Ortho-jet Acrylic Pink）	朗	1334-粉红	外科手术 & 基板连接
气流操控器	Neurotar	NTR000253-04	基板连接
阿莫西林	SIGMA	A8523-5G	外科手术
碳笼	Neurotar	180 mm × 70 mm	基板连接
卡洛芬	SIGMA	PHR1452-1G	外科手术
数据处理软件	INSCOPIX	INSCOPIX 数据处理软件	基板连接 & 行为测试
地塞米松	SIGMA	D1756-500MG	外科手术
钻孔	Seyang	马拉松-4	外科手术
钻孔钻头	ELA	US1/2，Shank104	外科手术
玻璃针	WPI	PG10165-4	外科手术
GRIN透镜（INSCOPIX Proview Lens Probe）	INSCOPIX	1050-002208	外科手术
Hamilton 注射器	Hamilton	84875	外科手术
头板	Neurotar	模型 5	手术
笔记本电脑	三星	NT950XBV	手术
透镜固定器，立体定位杆（INSCOPIX proview 植入套件）	INSCOPIX	1050-004223	外科手术
显微镜抓手	INSCOPIX	1050-002199	基板连接
显微镜，DAQ 软件，硬件	INSCOPIX	nVista 3.0	基板连接 & 行为测试
活动笼盒	Neurotar	MHC V5	基板连接
电动臂	Neurostar	定制化	外科手术
电动臂软件	Neurostar	定制化	外科手术
可移除环氧键	WPI	Kwik-Cast	外科手术
树脂粘接剂（Super-bond）	Sun医疗	Super bond C&B	外科手术
颅骨螺钉	Stoelting	51457	外科手术
立体定位仪	斯托尔丁	51600	手术
立体定位仪	斯托尔廷	51600	基板连接