自由活动小鼠中的实时微型内窥镜钙成像

摘要

来源：Lee, H. et. al., 在自由活动小鼠杏仁核中使用头戴式微型显微镜成功实现活体钙成像。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了在小鼠体内使用梯度折射率（GRIN）透镜和微型显微镜进行活体钙成像的技术。该实验装置结合了无摩擦移动笼系统中的头部固定，可刺激神经元并触发钙离子内流。GRIN透镜能够捕捉大脑中的钙信号，从而实现神经元活动的实时可视化。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

注意：本方案包含六个主要步骤：病毒注射手术、梯度折射率（GRIN）透镜植入手术、GRIN透镜植入效果验证、基板固定、在行为测试期间对GCaMP（绿色荧光蛋白（GFP）、钙调蛋白（CaM）与肌球蛋白轻链激酶来源的肽段M13的融合蛋白）信号进行光学记录，以及数据处理（图1A）。除手术步骤外，其余均使用商业软件套件（Inscopix）完成。

1. 立体定位手术——腺相关病毒（AAV）注射
注意：本手术所用小鼠品系为 C57BL6/J。手术过程中，小鼠身体需覆盖无菌手术单，所有操作步骤均需佩戴无菌手套进行。通常情况下，不建议在同一天进行多台手术。然而，若必须在同一天对多只小鼠实施相同手术，则每只小鼠应使用独立的一套经高压灭菌的手术器械，并在各只小鼠之间使用70%乙醇对手术器械进行消毒。为在手术过程中维持小鼠体温，将小鼠固定于立体定位仪后，需用定制的手术保温毯覆盖小鼠身体。

1. 使用70%乙醇对所有必需的手术器械进行消毒，并准备好Hamilton注射器和玻璃移液管。用蒸馏水填充玻璃移液管。
   注意： 本方案中使用的所有手术器械均已进行高压灭菌。由于GRIN透镜和颅骨螺钉不能高压灭菌，因此使用70%乙醇作为消毒剂以防止炎症。尽管尚未尝试，但也可使用其他形式的灭菌方法，例如气体或化学灭菌。
2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（83 mg∙kg⁻¹体重）麻醉小鼠。小鼠失去意识后，剃除颅骨表面的毛发。
3. 用70%乙醇清洁颅骨上方的皮肤，并将小鼠固定在立体定位仪上。小心地去除皮肤，并使用棉签蘸取35%过氧化氢溶液擦拭颅骨表面。涂抹润滑性眼膏，以防止手术期间角膜干燥。
   注意： 尽管通常仅使用70%乙醇进行无菌皮肤准备并无问题，但仍建议交替使用三种消毒剂（例如碘伏或氯己定溶液）和70%乙醇，共进行三轮消毒。本方案中使用较高浓度的过氧化氢，以确保尽可能彻底地去除小鼠颅骨上的结缔组织，这对于减少后续成像过程中的运动伪影至关重要，因为颅骨上的结缔组织会影响基板与颅骨的牢固粘附。需注意的是，35%过氧化氢的浓度远高于常规使用的浓度（3%）。
4. 将定位针固定在立体定位探针架上。调整前囟（bregma）和后囟（lambda）的高度，使其与定位针对齐。
5. 确定小鼠颅骨上开颅的位置。
   注意： 本方案中用于病毒注射的侧杏仁核（LA）坐标为（AP, ML, DV）=（-1.6 mm, -3.5 mm, -4.3 mm），以bregma为参考点（AP：前后方向，ML：内外方向，DV：背腹方向，各缩写表示相对于bregma的轴向距离）。各实验条件应优化相应坐标。
6. 钻开颅骨表面（图1B）。用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗颅骨碎屑。使用镊子或27 G针头去除残留组织。
   1. 钻颅骨时，尽量避免接触最内层的硬脑膜，以防损伤脑组织表面。脑表面受损会导致透镜周围发生炎症，从而在记录过程中引起严重的运动伪影和高自发荧光。开颅直径为1.6 mm。钻头转速为18,000 rpm，钻头尺寸为0.6 mm。
7. 为将GRIN透镜从钻孔处的脑组织表面下降至目标杏仁核位置，需计算一个称为“值A”的距离，即从基于bregma设定的透镜植入DV坐标（本例中为4.2 mm，图1C）减去bregma与暴露的脑表面之间的DV差值。
8. 在玻璃移液管中加载3 µL矿物油和0.7 µL AAV病毒溶液。
   注意： 矿物油有助于分离病毒溶液和水。0.7 µL是针对LA区域病毒注射的优化体积，可充分覆盖LA区域。
9. 从立体定位探针架上取下定位针，并将玻璃移液管固定于其上。
10. 将玻璃移液管定位至第1.5步所述的注射位点。待出血完全停止后，将玻璃移液管插入脑组织。
11. 使用注射泵通过玻璃移液管递送病毒。
    注意： 病毒滴度应高于1 × 10¹³ vg/mL，以获得足够数量表达GCaMP的细胞。注射速度为0.1 µL/min，扩散时间为10分钟。若出现出血，用PBS冲洗脑表面。此步骤中需保持脑表面湿润。
12. 完成注射后，缓慢取出玻璃移液管。

2. 立体定位手术——梯度折射率（GRIN）透镜植入
注意： GRIN透镜植入手术是本方案中最关键的步骤。由于GRIN透镜移动速度的稳定性至关重要，使用电动手术臂可能非常有帮助。电动手术臂是一种由计算机软件控制的立体定位操纵器。尽管本方案中采用了电动手术臂，但只要在植入过程中能保证透镜移动的稳定性和缓慢性，也可采用其他方法。有关该设备的详细信息见材料表。

1. 钻孔颅骨以植入两颗颅骨螺钉。用 PBS 冲洗所有颅骨碎片。
   注意： 为减少后续光学成像中的运动伪影，至少需要两颗螺钉。两颗颅骨螺钉与 GRIN 透镜植入位置构成一个等边三角形（图 1B）。开颅区域的尺寸应与螺钉直径紧密匹配。若出现出血，用 PBS 冲洗出血表面。钻头转速为 18,000 rpm，钻头尺寸为 0.6 mm。
2. 用 70% 乙醇对螺钉进行消毒，以防止炎症。尽可能深地植入螺钉。
   注意： 螺钉应牢固固定，无需额外粘合剂（如骨水泥）。
3. 在立体定位框架上安装电动手术臂。将所需硬件连接至安装有控制软件的笔记本电脑（材料表）。
4. 在降低 GRIN 透镜之前，准备使用 26 G 针头制作针道。
   注意： 针道是一种引导通道，有助于将相对较粗的 GRIN 透镜植入杏仁核等深部脑区，而不会在注射路径上造成严重的脑结构扭曲。此引导通道被称为针道，因其通过相对细的 26 G 针头的下降和提升操作形成。
5. 将套管夹持器安装到立体定位框架上，以稳定固定针头。
6. 用套管夹持器夹持 26 G 针头，并计算针头插入位置的坐标。
   注意： 在本方案中，针头插入位置的坐标为病毒注射位点外侧 50 µm 处（AP, ML, DV）= (-1.6 mm, -3.55 mm, -3.7 mm)。
7. 启动控制软件并完成针头位置操控的准备工作。
   1. 运行控制软件，点击 Start new project 按钮以开始控制会话。
      注意： 在控制会话中，有多个空白输入框和菜单按钮。空白框用于输入坐标。在空白框中输入坐标后，点击 Go To 按钮即可移动电动立体定位臂。当立体定位臂移动时，Go To 按钮将变为 STOP 按钮。在多个菜单按钮中，本方案仅需使用 Tool 按钮。
   2. 点击 Tool 按钮。通过点击 Calibrate the frame 菜单按钮校准控制软件。校准是将操纵器的实际位置设定为 Stereodrive 软件中数值的过程。
8. 使用立体定位操纵器将针头尖端定位至颅骨表面暴露的脑组织表面。
   注意： 针头移动速度通过 Tool 菜单中的 Microdrive speed 菜单设定。默认速度为 3.0 mm/s，但建议本步骤使用 0.5 mm/s。针头移动由方向键控制。
9. 滴加 2–3 滴 PBS 以保持脑表面湿润。在计算机屏幕的空白框中填入适当的 LA 区 DV 坐标。若脑表面干燥，会阻碍针头穿透脑组织。
10. 点击 Go To 按钮降低 26 G 针头。当针头到达由 DV 坐标设定的目标位置时，将自动停止。针头移动速度为 100 µm/min。若出现出血，点击 STOP 按钮暂停针头移动，并用 PBS 冲洗脑表面。本步骤中需持续保持脑表面湿润。待出血停止后，继续降低针头。
11. 当针头完全停止移动后，在计算机屏幕的空白框中输入 45.00 mm。
    注意： 45.00 mm 是使针头返回起始位置的 DV 坐标值。
12. 点击 Go To 按钮提升针头。针头移动速度为 100–200 µm/min。
13. 当针头停止移动后，清除脑表面的 PBS。从立体定位框架上卸下针头和套管夹持器。必要时，实验人员可手动点击 STOP 按钮停止针头。
14. 将透镜夹持器安装至立体定位杆上。将 GRIN 透镜装入透镜夹持器。
    注意： 本方案使用针对 LA 区优化的 GRIN 透镜（直径 0.6 mm，长度 7.3 mm）。若无透镜夹持器，可使用止血钳夹持 GRIN 透镜作为替代方法。
15. 用 70% 乙醇对透镜进行消毒，并将立体定位杆安装至立体定位框架上。
16. 将 GRIN 透镜尖端定位至颅骨表面指定位置（方法同步骤 2.8 所述）。
    注意： GRIN 透镜的坐标为 (AP, ML, DV) = (-1.6 mm, -3.55 mm, -4.2 mm)（图 1C）。透镜不应接触颅骨，以避免损伤其尖端。
17. 通过从步骤 2.16 所述的透镜植入 DV 坐标中减去“值 A”的绝对值，计算新的 DV 坐标。
18. 在脑表面滴加 2–3 滴 PBS。在计算机屏幕的空白框中输入降低透镜 1000 µm、提升透镜 300 µm 的数值。
19. 重复降低（向下 1000 µm）和提升（向上 300 µm）GRIN 透镜的操作，直至到达目标位置。此上下移动程序有助于释放因透镜下降而在脑组织内部产生的压力，否则可能导致植入路径上的脑结构扭曲。
    注意： GRIN 透镜移动速度为 100 µm/min。即使出现出血，也不要停止 GRIN 透镜的移动，并用 PBS 冲洗脑表面。本步骤中需持续保持脑表面湿润。若脑表面干燥，脑组织会粘附于 GRIN 透镜表面，导致脑结构扭曲。
20. 当 GRIN 透镜到达目标位置后，清除 PBS，并小心地在 GRIN 透镜、螺钉及其侧壁周围涂抹树脂牙科水泥（图 1D）。
    注意： 在整个颅骨上涂抹树脂水泥可能减少运动伪影。相反，若树脂水泥意外覆盖附着于颅骨的肌肉，则会增加运动伪影。
21. 待树脂牙科水泥硬化后，将 GRIN 透镜从透镜夹持器上拆下，并在整个颅骨上涂抹丙烯酸水泥（图 1D）。
22. 为安装头板，将透镜夹持器从立体定位杆上拆下，并使用胶带将头板固定在杆的末端。确认头板是否水平。
    注意： 倾斜的头板会导致视野倾斜。头板用于在移动家庭笼系统中固定小鼠头部（见底板安装部分）。若实验人员不使用该系统，可跳过本步骤（步骤 2.22）及后续步骤 2.23。
23. 缓慢降低定位杆，直至头板位于透镜套管顶部。再将头板降低 1000 µm。移动头板，使已植入的 GRIN 透镜位于头板内环的右侧边缘。
    注意： 头板应低于已植入的 GRIN 透镜表面；否则，由于丙烯酸水泥的存在，微型内窥镜无法足够接近已植入的 GRIN 透镜以调节焦平面。
24. 涂抹丙烯酸水泥将头板固定于水泥层上（图 1D）。
25. 在已植入的 GRIN 透镜表面覆盖一层石蜡膜，以保护透镜表面免受灰尘污染。然后在石蜡膜上涂抹可移除的环氧胶，以固定石蜡膜在透镜表面的位置。
26. 在小鼠腹腔内注射镇痛药卡洛芬（Carprofen，0.5 mg/mL in PBS）和抗炎药地塞米松（Dexamethasone，0.02 mg/mL in PBS）溶液。
    注意： 药物剂量根据体重确定：卡洛芬（5 mg∙kg⁻¹ 体重），地塞米松（0.2 mg∙kg⁻¹ 体重）。手术后及术后 7 天内每日给药一次。
27. 在家庭笼饮用水中加入 0.3 mg/mL 的抗生素阿莫西林（amoxicillin），持续给药 1 周。
28. 将小鼠放回家庭笼，并给予 5–8 周恢复期以完成病毒转导。
    注意： 小鼠在电热毯上的预热笼中恢复，直至从麻醉中苏醒。

3. GRIN 透镜植入的验证
注意：GRIN 透镜植入的验证可提供信息，判断植入的 GRIN 透镜是否准确对准表达 GCaMP 的细胞。基于此信息，实验人员可排除透镜植入位置偏差的动物，从而避免在耗时的行为测试和数据处理上浪费时间。在验证过程中，应将表达 GCaMP 的细胞聚焦于记录视野中。此步骤使用一种可移动的饲养笼。可移动饲养笼是一种特制的圆形装置，允许头部固定的实验小鼠在验证 GRIN 透镜植入和基板固定时自由活动其腿部。该装置配备一个气浮台，用于支撑头部固定小鼠的腿部，使其在头部固定的同时仍能自由移动腿部。杏仁核外侧核的细胞在静息或麻醉状态下通常处于静默状态，因此在这些条件下很少能检测到 GCaMP 荧光信号，这使得在验证 GRIN 透镜植入和基板固定时很难甚至无法定位表达 GCaMP 的细胞。然而，腿部的运动常会引发杏仁核外侧核细胞中 GCaMP 荧光信号的出现，从而有助于显微镜的定位。因此，本实验方案中使用可移动饲养笼。

1. 将立体定位仪组装到移动式家庭笼系统中。
2. 用1.5%异氟烷气体麻醉小鼠。待小鼠完全失去意识后，将其放置于移动式家笼系统的头固定杆上。
3. 将碳笼置于小鼠下方。关闭碳笼并打开气流，使笼子能够无摩擦自由移动。等待数分钟，直至小鼠恢复活跃状态。
   注意： 气流速度应针对每种实验条件进行优化（此处为100 L/min）。
4. 移除植入的GRIN透镜表面的石蜡膜和环氧树脂胶，并使用镜头纸蘸取70%乙醇擦拭透镜表面。
5. 准备数据采集（DAQ）软件（例如 Inscopix），设置成像条件。
   注意： DAQ 软件用于控制显微镜（发光二极管（LED）功率、镜头焦距等）.）和数据存储。
   1. 打开数据采集箱，并将显微镜连接至该设备。然后，使用数据线直接连接或通过无线网络将其连接到笔记本电脑。
      注意： 数据采集软件安装在称为数据采集盒（DAQ盒）的额外硬件中（例如 Inscopix）。通过将 DAQ 盒连接到笔记本电脑，即可在笔记本电脑上访问数据采集软件。
   2. 通过互联网浏览器访问DAQ软件（推荐使用Firefox）。
   3. 设置所有必要信息（日期、小鼠编号等）.) 在 定义的实验环节然后点击 保存并继续保存后，访问 运行实验.
   4. 在 运行实验设置成像条件，如曝光时间、增益、电子对焦和曝光LED功率。
      注意： 增益和曝光-LED 功率可根据实验室条件进行调整。电聚焦的推荐值为 500，曝光时间为 50 ms。对 LED 功率和增益的调整没有限制。然而，较高的光照强度可能导致更明显的漂白。录像的曝光时间决定了视频录制的帧率。较高的帧率会降低信号强度。应根据成像所用的 GECIs 优化帧率。
6. 将显微镜固定在立体定位操纵器上时，需将立体定位杆通过显微镜夹持器连接至立体定位操纵器。
   注意： 夹持器是一种小型附件，可安装在立体定位仪上，用于固定显微镜主体，以便将其放置到目标脑区位置。
7. 用显微镜夹持器固定显微镜。打开连接显微镜的LED光源，并将显微镜调整至垂直位置。一边观察成像，一边降低显微镜，直至植入的GRIN透镜表面清晰可见。
8. 将植入的GRIN透镜中心与视野中心对齐。
   注意： 此步骤可用于验证GRIN透镜植入效果（见结果部分所述） 图2B，图2D，图2F).
9. 拍摄植入的GRIN透镜表面图像（点击 Prt Sc 键盘上的按钮）。植入的GRIN透镜表面的图像在后续数据处理过程中用于取消选择非神经元成分（步骤6.8）。
10. 找到显微镜的合适位置。在观察图像的同时缓慢提升显微镜的物镜，以寻找表达GCaMP7b的细胞。
    注意： 可能需要调整图像采集的增益或曝光LED的功率。此步骤可用于验证GRIN透镜的植入效果（见结果部分所述）。 图2A，图2C，图2E).

结果

图1：LA区体内微内窥镜钙成像立体定位手术的示意图与流程图。 （A）LA区体内微内窥镜钙成像的示意图流程。（B）显示病毒注射和GRIN透镜植入手术开颅位点二维坐标的显微图像。两枚颅骨螺钉与透镜构成一个等边三角形。（C）病毒注射位点与植入式GRIN透镜之间相对位置的示意图，以及“值A”计算方法的图解说明。（D）手术最后步骤中从颅骨表面至头固定板的水泥层...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26G针头	BD	302002	手术
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	手术
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	定制		外科手术
丙烯酸牙科水泥（Ortho-jet Acrylic Pink）	朗	1334-粉红	外科手术 & 基板连接
气流操控器	Neurotar	NTR000253-04	基板连接
阿莫西林	SIGMA	A8523-5G	外科手术
碳笼	Neurotar	180 mm × 70 mm	基板连接
卡洛芬	SIGMA	PHR1452-1G	外科手术
数据处理软件	INSCOPIX	INSCOPIX 数据处理软件	基板连接 & 行为测试
地塞米松	SIGMA	D1756-500MG	外科手术
钻孔	Seyang	马拉松-4	外科手术
钻孔钻头	ELA	US1/2，Shank104	外科手术
玻璃针	WPI	PG10165-4	外科手术
GRIN透镜（INSCOPIX Proview Lens Probe）	INSCOPIX	1050-002208	外科手术
Hamilton 注射器	Hamilton	84875	外科手术
头板	Neurotar	模型 5	手术
笔记本电脑	三星	NT950XBV	手术
透镜固定器，立体定位杆（INSCOPIX proview 植入套件）	INSCOPIX	1050-004223	外科手术
显微镜抓手	INSCOPIX	1050-002199	基板连接
显微镜，DAQ 软件，硬件	INSCOPIX	nVista 3.0	基板连接 & 行为测试
活动笼盒	Neurotar	MHC V5	基板连接
电动臂	Neurostar	定制化	外科手术
电动臂软件	Neurostar	定制化	外科手术
可移除环氧键	WPI	Kwik-Cast	外科手术
树脂粘接剂（Super-bond）	Sun医疗	Super bond C&B	外科手术
颅骨螺钉	Stoelting	51457	外科手术
立体定位仪	斯托尔丁	51600	手术
立体定位仪	斯托尔廷	51600	基板连接