体外肌萎缩侧索硬化模型中突触钙动力学的荧光成像

摘要

来源：Krishnamurthy, K. et al. 肌萎缩侧索硬化模型中突触功能的实时荧光检测。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用实时钙成像技术监测表达遗传编码钙生物传感器的肌萎缩侧索硬化症（ALS）突变神经元中的突触活动。视频概述了成像前神经元的准备步骤、钙动力学的刺激方法以及荧光信号的记录，以测量反映神经元突触活动的细胞内钙离子水平的实时变化。

方案

1. Gcamp6m 钙瞬变的荧光成像

1. 在35 mm玻璃底培养皿中培养的原代啮齿类动物皮层神经元中转染500 ng Gcamp6m。
   注意： 如有需要，可将含有红色或远红光范围荧光标签的目的质粒与神经元共转染。
2. 用低氯化钾（KCl）人工脑脊液（aCSF）孵育神经元（表1转染后48小时，孵育15分钟，然后将培养皿置于成像平台上。
3. 使用异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片（488 nm）和20倍或40倍物镜观察GCaMP6m荧光。
4. 选择成像区域并启用完美聚焦功能。随后，使用明场、FITC和荧光标记通道拍摄一张静态图像，以标记神经元边界。
5. 启动 立即运行 在采集软件中进行基线记录5分钟，然后灌注含有50 mM KCl的aCSF（人工脑脊液）表1).
   注意： 本成像的目标是测量诱发的钙瞬变。若神经元在刺激前时期存在基础放电活动及钙流，则该细胞不用于数据分析；仅选用背景荧光稳定的细胞。刺激后时期也可延长至60分钟以记录钙瞬变，可选择是否在此期间持续灌注高浓度KCl溶液。
6. 保存实验并使用共聚焦软件分析数据。此时可终止实验，分析可后续进行。​
   注意： 如果细胞无需转染即可表达目的蛋白，则可在任意时间点执行本方案 体外 在检测钙瞬变时，应先对对照细胞进行测试，以确保钙瞬变测量的有效性。实验人员应对每个培养皿所处的遗传或药理条件设盲，以最大限度减少偏倚。

2. 图像分析

1. 使用共聚焦软件打开延时图像。
2. 通过命令序列：图像 | 处理 | 对齐当前文档，对延时序列图像进行对齐。选择对齐到第一帧。
3. 使用ROI选择工具（图像窗口右侧的豆形图标）沿神经突选择感兴趣区域（ROIs）。同时，标记一个代表背景荧光强度的ROI。
   注意：通过明场静态图像中标示的神经元轨迹上明显分离的点状结构区域来选择ROIs。每个神经元至少选择五个ROIs用于分析。背景ROI应选在视野中不含神经突的区域。
4. 使用以下命令序列测量所选ROIs随时间变化的原始荧光强度：测量 | 时间测量。
   1. 在时间测量面板的上方启动测量功能，将生成原始荧光随时间变化的图形表示及定量数据。
      注意：每个数据点代表该ROI在对应特定测量时间点的帧中的原始荧光强度。
5. 将原始荧光强度导出至电子表格软件。

表1：人工脑脊液（aCSF）缓冲液的成分。

低KCl aCSF缓冲液（pH 7.40至7.45）
试剂	浓度
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
葡萄糖	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
高KCl aCSF缓冲液（pH 7.40至7.45）
试剂	浓度
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
葡萄糖	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20倍空气物镜	Nikon		用于成像
40倍油浸物镜	Nikon		用于成像
B27添加剂	Thermo Scientific	17504044	神经元生长添加剂
BD无针注射器，50 mL	Thermo Scientific	13-689-8	重力灌注装置的组成部分
生物安全细胞培养罩	Baker	SterilGARD III SG403A	用于无菌细胞培养、转染和染料加载
β-巯基乙醇	Millipore Sigma	M3148	用于神经元培养物的培养与维持
牛血清白蛋白	Millipore Sigma	A9418	用于制备神经元培养物
二水合氯化钙	Millipore Sigma	223506	aCSF溶液的组分
细胞培养用二氧化碳培养箱	Thermo Scientific	13-998-123	用于神经元的培养与维持
共聚焦显微镜	Nikon	Eclipse Ti +A1R核心	用于荧光成像
CoolSNAP ES2 CCD相机	Photometrics		用于图像采集
D-葡萄糖	Millipore Sigma	G8270	aCSF溶液的组分
FITC滤光立方体	Nikon	77032509	用于成像Gcamp钙瞬变
玻璃底培养皿（厚度#1.5）	CellVis	D35-10-1.5-N	用于在适用于成像的培养皿上培养神经元
HEPES	Millipore Sigma	H3375	aCSF溶液的组分
高KCl人工脑脊液（aCSF）			用于成像
马血清	Millipore Sigma	H1138	用于神经元的培养与维持
层粘连蛋白	Thermo Scientific	23017015	用于制备神经元培养物
Leibovitz's L-15培养基	Thermo Scientific	11415064	用于制备神经元培养物
不含酚红的Leibovitz's L-15培养基	Thermo Scientific	21083027	用于制备神经元培养物
L-谷氨酰胺（200 mM）	Thermo Scientific	25030149	神经元培养添加剂
Lipofectamine 2000转染试剂	Thermo Scientific	11668019	用于神经元转染
低KCl人工脑脊液（aCSF）			用于成像
氯化镁	Millipore Sigma	208337	aCSF溶液的组分
Microsoft Excel	Microsoft		用于数据分析/归一化的软件
Nalgene滤器单元，0.2 µm PES	Thermo Scientific	565-0020	aCSF溶液用滤器单元
Neurobasal培养基	Thermo Scientific	21103049	用于神经元培养物的培养与维持
NIS-Elements高级研究软件	Nikon		用于图像采集与分析的软件
Nunc 15 mL锥形管	Thermo Scientific	339650	用于制备神经元培养物和缓冲液
Nunc 50 mL锥形管	Thermo Scientific	339652	用于制备神经元培养物和缓冲液
Optiprep	Millipore Sigma	D1556	用于制备神经元培养物
木瓜蛋白酶	Millipore Sigma	P4762	用于制备神经元培养物
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Scientific	15140122	用于防止神经元培养物的细菌污染
灌注系统	Warner Instruments	SF-77B	用于aCSF的更换
灌注管路	Cole-Parmer	UX-30526-14	重力灌注装置的组成部分
pGP-CMV-Gcamp6m质粒	Addgene	40754	用于成像钙瞬变
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Millipore Sigma	P7886	玻璃底培养皿的包被剂
氯化钾	Millipore Sigma	P3911	aCSF溶液的组分
碳酸氢钠	Millipore Sigma	S5761	aCSF溶液的组分
氯化钠	Millipore Sigma	S9888	aCSF溶液的组分
载物台培养箱	Tokai Hit		用于成像期间活神经元的孵育
TRITC滤光立方体	Nikon	77032809	用于成像FM4-64
振动隔离台	New Port	VIP320X2430-135520	显微镜用台/支架