肌萎缩侧索硬化症体外模型中突触钙动力学的荧光成像

摘要

来源：Krishnamurthy， K. et al. 肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光测量。J. Vis. Exp. （2021）

该视频演示了实时钙成像，以监测表达基因编码钙生物传感器的 ALS 突变神经元的突触活动。它概述了准备神经元进行成像、刺激钙动力学和记录荧光以测量细胞内钙水平（反映神经元突触活动）的实时变化的步骤。

方案

1. Gcamp6m 钙瞬变的荧光成像

1. 用 500 ng Gcamp6m.
   注意：如果需要，用含有红色或远红色荧光标签的目标质粒共转染神经元。
2. 将神经元与低氯化钾 （KCl） 人工脑脊液 （aCSF）（表 1）孵育 15 分钟，转染后 48 小时，然后将培养皿安装在成像平台上。
3. 使用异硫氰酸荧光素 （FITC） 滤光片 （488 nm） 和 20 倍或 40 倍物镜观察 GCaMP6m 荧光。
4. 选择成像区域并进行完美对焦。接下来，拍摄一张带有明场、FITC 和荧光标记通道的静止图像来标记神经元边界。
5. 在采集软件中启动 Run Now。进行基线记录 5 分钟，然后用含有 50 mM KCL 的 aCSF 灌注（表 1）.
   注意：该成像的目标是测量诱发的钙瞬变。如果神经元在预刺激期间具有基础放电活性和钙通量，则不用于数据分析。相反，仅使用具有稳定背景荧光的细胞。对于钙瞬变，刺激后期也可以延长至 60 分钟，有或没有额外的连续高 KCl 灌注。
6. 保存实验并使用共聚焦软件分析数据。此时可以停止实验，稍后进行分析。
   注意：如果细胞不需要转染来表达目标蛋白质，则当寻求检查钙瞬变时，可以在体外的任何时间点执行此方案。在对对照细胞进行测试以确保钙瞬变的测量之后，实验者应该对每个测试皿的遗传或药理条件不知情，以尽量减少偏倚。

2. 图像分析

1. 使用共聚焦软件打开延时图像。
2. 通过命令系列对齐延时系列中的图像：图像 |加工 |对齐当前文档。选择 Align to the First Frame（对齐到第一帧）。
3. 使用 ROI 选择工具沿神经突选择感兴趣区域 （ROI），该工具是图像框架右侧的豆形图标。此外，标记代表背景荧光强度的 ROI。
   注意：ROI 是通过选择沿明场静止图像指示的神经元轨迹明显分离的点状区域来选择的。每个神经元至少选择五个 ROI 进行分析。背景 ROI 是在不包含神经突的视野区域中选择的。
4. 使用以下命令系列测量所选 ROI 随时间变化的原始荧光：测量 |时间测量。
   1. 在"时间测量"面板的上部启动"测量"功能。
      注意：每个数据点代表与该特定测量时间点相关的帧中该 ROI 的原始荧光。
5. 将原始荧光强度导出到电子表格软件。

表 1：人工脑脊液 （aCSF） 缓冲液的成分。

低 KCL aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂	浓度
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
葡萄糖	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM
高 KCL aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂	浓度
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50 mM
葡萄糖	10 mM
CaCl2 2 小时2O	2 毫米
MgCl2 4小时2O	1 毫米

材料