$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 头部固定板植入（图1A）
- 腹腔注射麻醉剂（74 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪的混合物）以麻醉小鼠。通过频繁检测足底反射来评估小鼠的麻醉状态。
- 麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪中。涂抹眼膏（见材料表），以防止在植入头板时角膜干燥。
- 剃除手术区域的毛发，并使用聚维酮碘或氯己定溶液与70%酒精棉片交替擦拭三次进行皮肤消毒。小心暴露颅骨，并用棉签清洁。
注意：所有手术器械均应灭菌，所有操作均应遵循无菌原则。任何残留的碎屑（如毛发或干涸的血液）都可能引发炎症反应。因此，应在体视显微镜下使用无菌水或70%酒精润湿的棉签彻底清除所有碎屑。 - 使用立体定位坐标——前后方向距前囟0.5 mm，内外方向距前囟1.5 mm——确定颅骨开窗的中心位置，并用记号笔标记。
- 将定制的头板置于颅骨中央。随后，涂抹牙科水泥（见材料表）将其牢固固定在颅骨上。施加轻压，直至头板与颅骨前部和后部紧密贴合。
注意：此步骤约需20分钟完成，对于减少双光子成像过程中脑组织的运动伪影至关重要。头板尺寸为20 mm × 40 mm × 1 mm，其开口呈“H”形，其中一边长15 mm，两个相邻边各长3 mm，其余两边各长10 mm。 - 按如下比例混合丙烯酸类牙科粘接树脂水泥：半勺粉末、三滴液体和一滴催化剂（见材料表）。为防止干燥，将混合好的牙科粘接树脂水泥涂抹于安装头板后仍保留完整的颅骨表面。
- 将小鼠置于保温笼中，直至其从麻醉中恢复。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得离开无人看护状态。
2. 手术与腺相关病毒（AAV）注射（图1B）
- 在植入头固定板1天后，无需去除颅骨上的牙科粘接树脂胶进行开颅或病毒注射。
注意：在此过程中，通过腹腔注射给予小鼠麻醉剂（74 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪的混合物）。 - 为避免脑水肿，在手术前1小时通过腹腔注射给予地塞米松磷酸钠（1.32 mg/kg）。
- 使用蒸发器（麻醉输送系统）以1%异氟烷麻醉固定头固定板的小鼠，同时使用加热垫维持体温。涂抹眼膏以防止角膜干燥。
- 在体视显微镜下，使用牙科钻进行直径约2 mm的环形开颅。为减少脑组织损伤，操作牙科钻时应小心，保持持续轻微移动和轻度向下的压力。
- 多次使用抽吸系统清除骨碎片。清除骨碎片后，使用人工脑脊液（ACSF）溶液清洗脑表面残留的碎屑。重复此清洗过程数次，以抑制炎症反应。
注意： ACSF溶液（140 mM 氯化钠，NaCl；2.5 mM 氯化钾，KCl；5 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，HEPES；2.0 mM 氯化钙，CaCl2；以及1.0 mM 氯化镁，MgCl2）在试剂溶解并过滤（孔径=0.22 µm）后于4 °C保存1个月。 - 使用压力注射系统（见材料表），设定适当压力（约10磅每平方英寸（PSI），脉冲持续时间为4 ms），通过尖端直径为10–20 µm（使用微移液器拉制仪制备）的玻璃毛细管在10分钟内注射500 nL的AAV溶液。
- 通过观察玻璃毛细管中AAV溶液液面是否逐渐下降，判断AAV溶液是否正在注入脑内。
- 将玻璃毛细管原位保留额外10分钟，以防止回流。重复三次，共向脑内注射1.5 µL的AAV溶液。
- 为评估和操控第2/3层（L2/3）锥体细胞的神经活动，将AAV溶液（用于Ca2+成像：AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE，1.28 × 1014 载体基因组/mL，生理盐水1:1稀释；用于结合光遗传学的Ca2+成像：AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE，1.73 × 1014 载体基因组/mL，生理盐水1:1稀释）注射至野生型小鼠初级躯体感觉皮层的后肢足垫区域（S1，以bregma后0.5 mm、外侧1.5 mm为中心，深度为脑表面下150 µm）。
注意： AAV溶液应在成像前2–3周和1–2周分别注射，以表达jGCaMP8f和GCaMP6m-P2A-ChRmine。 - 使用微量移液器在S1脑表面施加2%（w/v）低熔点琼脂糖后，将玻璃窗覆盖于开颅区域，使用两片盖玻片。用紫外（UV）固化粘接剂固定两片盖玻片（小片直径2.0 mm，大片直径4.5 mm；见材料表）。
- 在琼脂糖仍为液态时将盖玻片压紧，以防止琼脂糖中形成气泡。用牙科粘接树脂胶密封颅窗边缘（图1C）。
- 将小鼠从立体定位仪上移出并放回笼中。将小鼠置于温暖的笼中，并在其完全从麻醉中恢复前不得与其他动物合笼。在存活手术期间严格保持无菌条件。
- 术后前72小时内，通过观察一般行为检查小鼠的健康状况。若发现一般行为异常，应皮下注射抗炎和镇痛药物。
3. 全息刺激或照明系统的准备（图2）
- 通过将红色荧光载玻片（亚克力基底）表面置于样品平面来校准全息刺激系统。将显微镜置于实时成像模式并使用弱激发光，运行 calibration_GUI.m 文件。检查参数面板，然后点击 保存 按钮。
- 点击步骤1面板中的 Z 扫描 按钮。系统将自动生成21个轴向平面中的三个随机光斑，每个平面之间相距 2 µm。
- 移动滑动条并观察实时图像。找到一个光斑最小且最亮的最佳焦平面，然后点击 保存 按钮。这将自动为数字全息图生成一个偏移的球面波前。
注意： 如果未能找到最亮的荧光光斑，请调整扫描范围的最小值和最大值后重试。 - 点击步骤2面板中的 前往 按钮，然后在左侧方框中点击六个光斑。检查实时图像。如果出现六个可区分的荧光光斑，则将其 x 和 y 坐标输入到编辑框中，并点击 保存 按钮。这将自动生成仿射变换系数，以实现全息刺激系统与成像系统之间的坐标校准。
注意： 坐标对的顺序必须与所点击的光斑顺序一致。如果不确定，或图像中未出现光斑，请重试并生成独特的光斑图案，或选择围绕视场中心（FOV）更小的范围。 - 点击步骤3面板中的 扫描 按钮。系统将生成 441 个数字全息图，在 21 × 21 步内完成在整个视场（FOV）上的单光斑扫描。
- 首先，在列表框中切换图案并观察图像变化。然后，调节激光功率，使光斑图像处于成像设备的动态范围之内（例如，避免图像过度饱和）。
- 随后，在编辑框中调节时间间隔；该时间间隔应大于记录时间间隔的两倍。最后，将成像设备设为记录模式，点击 播放 按钮。若播放完成，命令窗口将显示“display OK”字符串。停止记录，并使用最大强度法叠加所记录的连续图像。
- 在步骤4面板中点击 生成 WM，并从上方选择一幅叠加图像。然后关闭 calibration_GUI 窗口。系统将自动生成权重图，用于补偿各光斑间强度不均的问题。
注意： 如需更详细的说明，可从此处下载 MATLAB 代码（https://github.com/ZenKG/SLM_control）。
4. 使用全息照明图像传感器进行 Ca2+ 成像（图3）
- 将注射了AAV并带有头板的小鼠置于显微镜下图1D).
注意： 在该操作过程中，小鼠处于清醒状态并被固定，但能够逃避不适刺激。 - 使用全息显微镜和锁模钛宝石激光器（波长调至920 nm）在点扫描模式下进行双光子成像，物镜为25倍（参见 材料表).
- 打开商用成像软件（参见 材料清单）。在活体成像模式下，调节图像检测器的电压（参见 材料表）并调整成像激光的功率以优化表达jGCaMP8f的神经元的亮度。采集表达该蛋白的神经元图像。
注意： 成像激光（920 nm）的强度为20-30 mW。视野（FOV）为512 µm × 512 µm，成像深度位于皮层表面下100-150 µm处。 - 为了通过全息照明激活表达 jGCaMP8f 的特定神经元，请运行 SLMcontrol.m 脚本文件。点击 参考图像 并选择上方获取的图像。然后，单击 斑点 通过连续点击鼠标，在图像中的神经元上选择特定像素图3A）。若选择完成，按 输入 键盘上的按钮以确认完成。
注意： 数字全息图会自动计算并显示在空间光调制器（SLM）上。通过点击列表框也可重新调用该图案。SLM生成的单个光斑的空间分辨率在横向约为1.2 µm，沿光轴方向约为8.3 µm。我们采用高数值孔径（1.1）的物镜，以实现更局域化的全息刺激。 - 使用图像传感器以高时间分辨率检测神经活动（参见 材料表），设置曝光时间、成像区域和像素合并（binning）（图3B）在进行图像采集之前（图3C).
注意： 全息照明激光器（920 nm）持续刺激单个神经元的光强为 2 mW，足以检测神经活动。例如，当成像帧率为 100 Hz 时，曝光时间为 9 ms，成像区域为 400 µm × 400 µm，像素合并（binning）为 4。 - 实验结束后，将小鼠放回其原居住的笼具中。
5. 使用全息显微镜进行双光子成像（点扫描模式）并结合光遗传学技术（图4）
- 重复步骤 4.1 和 4.2。
- 启动商用成像软件（见材料表）。在实时成像模式下，调节图像探测器（见材料表）的电压和成像激光的功率，以优化表达 GCaMP6m-P2A-ChRmine 的神经元的亮度。采集表达这些蛋白的神经元的图像（图 1E）。
- 重复步骤 4.4。
- 为研究 L2/3 神经元内的功能连接性，使用空间光调制器（SLM）生成光遗传学刺激（ChRmine；1,040 nm）的全息图样，并将其与双光子 Ca2+ 成像（GCaMP6m；920 nm，512 × 512 像素，2 Hz 或 30 Hz，2 倍数字放大，点扫描模式；图 3D-H）结合使用。
- 在本方案中，将成像激光的波长设为 920 nm，功率为 10–20 mW，视野（FOV）设为从皮层表面下 100–150 µm 深度处测量的 256 µm × 256 µm。对于 2 Hz 成像，像素驻留时间设为 1.5 µs；对于 30 Hz 成像，设为 100 ns。
- 为检测单个全息刺激是否在神经元中引发钙反应，同时使用 2 Hz 和 30 Hz 作为成像帧率。将用于刺激单个神经元的全息刺激激光（1,040 nm）强度设为 10 mW，该强度足以诱导神经元活动（图 3D）。
注意：空间光调制器（SLM）生成的单个光斑的空间分辨率在横向方向约为 1.2 µm，在光轴方向约为 8.3 µm。横向可访问体积范围约为 500 µm × 500 µm，轴向约为 100 µm。我们进一步通过在 2 Hz 或 30 Hz 成像帧率下的 Ca2+ 成像证实，不仅可单独刺激单个神经元，还可同时全息刺激多个神经元（图 3E）。
- 按照以下方案进行图像采集：在 10 秒基线期后，以 8 秒间隔（0.125 Hz）同时在 920 nm 下成像 Ca2+ 反应，并在 1,040 nm 下施加 10 次持续 50 ms 的全息刺激。
