双光子全息显微技术用于研究小鼠模型中的神经活动与连接性

摘要

来源：Kato, D. 等.，利用双光子全息显微镜评估与操控神经活动。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了结合全息显微镜的双光子成像技术与光遗传学方法。利用空间光调制器，该技术能够实现表达红光敏感蛋白的神经元的精确刺激，同时以最小的光损伤进行钙成像。该方法为研究神经网络的功能连接性和组织结构提供了深入见解。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 头部固定板植入（图1A）

1. 腹腔注射麻醉剂（74 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪的混合物）以麻醉小鼠。通过频繁检测足底反射来评估小鼠的麻醉状态。
2. 麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪中。涂抹眼膏（见材料表），以防止在植入头板时角膜干燥。
3. 剃除手术区域的毛发，并使用聚维酮碘或氯己定溶液与70%酒精棉片交替擦拭三次进行皮肤消毒。小心暴露颅骨，并用棉签清洁。
   注意：所有手术器械均应灭菌，所有操作均应遵循无菌原则。任何残留的碎屑（如毛发或干涸的血液）都可能引发炎症反应。因此，应在体视显微镜下使用无菌水或70%酒精润湿的棉签彻底清除所有碎屑。
4. 使用立体定位坐标——前后方向距前囟0.5 mm，内外方向距前囟1.5 mm——确定颅骨开窗的中心位置，并用记号笔标记。
5. 将定制的头板置于颅骨中央。随后，涂抹牙科水泥（见材料表）将其牢固固定在颅骨上。施加轻压，直至头板与颅骨前部和后部紧密贴合。
   注意：此步骤约需20分钟完成，对于减少双光子成像过程中脑组织的运动伪影至关重要。头板尺寸为20 mm × 40 mm × 1 mm，其开口呈“H”形，其中一边长15 mm，两个相邻边各长3 mm，其余两边各长10 mm....

结果

图1：实验流程示意图。 （A）将头固定板固定到颅骨上。（B）将AAV立体定位注射至初级躯体感觉皮层（S1HL）的后肢区域。（C）颅窗植入。为评估和调控神经活动，在清醒小鼠中进行体内 Ca²⁺成像（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25倍物镜	Nikon	N25X-APO-MP	物镜
A1MP	Nikon	A1MP	显微镜
AnesII	Bio machinery	AnesII	麻醉输送系统
C2 plus	Nikon	C2 plus	显微镜
DECADRON 磷酸盐注射液	Aspen	21N024	预防脑水肿
牙科钻头	Jota	C1.HP.005	牙科钻头
电动微注射仪	NARISHIGE	IM-31	压力注射系统
羽毛	FEARGER	FA-10	剃毛
G-CEM one 黏结增强底涂剂	GC	2110271	牙科黏结用树脂水门汀底涂剂
G-CEM ONE neo	GC	43093	牙科黏结用树脂水门汀
带细丝的玻璃毛细管	NARISHIGE	GDC-1	玻璃毛细管
图像探测器	Hamamatsu	H10770PA-40	GaAsP光阴极光电倍增管
成像软件	Nikon	NISelements	成像软件
异氟烷吸入溶液	Pfizer	229KAR	麻醉剂
iXon EMCCD 相机	Andor	iXon Life 888	图像传感器
氯胺酮	daiitisannkyou	s9-018506	麻醉剂
Leica-M60	Leica	M60	体视显微镜
Linicon	Linicon	LV-125	真空泵
锁模钛宝石 Chameleon Ultra II 激光器	Coherent	Chameleon Discovery NX	飞秒激光器
Mos-cure	U-VIX	mini 365	便携式LED紫外光源
PEN bright	SHOFU INC.	PEN Bright	牙科光固化仪
拉针仪	SUTTER instaument	P-97	拉针仪
立体定位仪（小鼠用）	NARISHIGE	SR-6M-H	立体定位仪
立体定位微操作器	NARISHIGE	SM-15R	立体定位微操作器
Super-bond CATALYST V	SUN MEDICAL	8070	牙科黏结性树脂水门汀
Super-bond 牙科黏结单体	SUN MEDICAL	8071	牙科黏结单体
Super-bond 牙色聚合粉	SUN MEDICAL	145052000	牙色聚合粉
0.3% 泰利必妥眼膏	Santen Pharmaceutical	TRN3952	眼膏
UlTIMATE XL	NSK	Y141446	牙科实验室微型电机控制单元
紫外固化光学胶	THORLABS	NOA61	紫外固化光学胶
赛拉嗪	Bayer	KP0F2BK	麻醉剂