使用微型显微镜对小鼠内侧前额叶皮层进行实时钙成像

摘要

来源： Thapa, R., 等 立体定向病毒注射与梯度折射率透镜植入用于深部脑区 体内 钙成像 视频实验杂志 (2021)

该视频展示了在转导小鼠中使用微型显微镜进行实时钙成像，以关联神经元活动与行为。

方案

微型显微镜安装与活体 Ca²⁺ 成像（图1）

1. 将微型显微镜安装至其底座
   1. 将小鼠在诱导室中短暂麻醉（5% 异氟烷，氧气流速为 1 L/min）。将小鼠置于洁净的实验台表面。
   2. 用小螺丝刀松开锁定螺丝，取下保护帽，并用浸有丙酮的棉签清洁梯度折射率透镜（GRIN透镜）表面。
   3. 用聚四氟乙烯（PTFE）胶带紧密缠绕微型显微镜的螺纹部分，并将微型显微镜牢固地旋紧在小鼠头部的基座上。
   4. 将微型显微镜连接至电缆（图 2K），然后启动 NeuView 软件。
   5. 在 NeuView 中，单击 硬件，检查 LED1，然后点击 流 单击按钮以查看实时图像（图3A).
   6. 通过使用钝头镊子轻微拧紧或松开微型显微镜与底座之间的连接，调整微型显微镜相对于底座的位置，以确定最佳焦平面。
      注意： 通过比较多个可能的焦平面位置，选择其中能够清晰显示大多数细胞体的一个作为最佳焦平面。
   7. 拧紧锁定螺丝，然后将小鼠放回其饲养笼中。
   8. 在 NeuView 中，将 LED 光源功率调节至最佳水平。点击 捕获 然后 触发 开始录制的按钮并点击 停止 150 帧后。
      注意： 最低的功率即可确定LED光源的最佳功率水平，以获得足够明亮的图像。录制短时视频的目的是便于在后续重复成像时识别相同的焦平面。
   9. 将电缆从微型显微镜上断开。在开始实验前，让小鼠恢复至少30分钟。
      注意： 为了保护微型显微镜，通常在此短暂期间内移除水瓶和有线饲料喂食器。若小鼠需要在笼内停留较长时间，建议提供市售的饮食凝胶（参见 材料列表在家庭饲养笼中。
2. 数据采集用于 体内 钙成像
   注意： 在体内， 钙成像可与研究人员希望进行的任何行为学测试同时开展。为演示起见，此处示例为 体内 Ca²⁺ 开放场测试中的成像。为实现这一目标，需要两台计算机。其中一台计算机配备商业软件（参见 材料表）来控制相机，以自动记录小鼠行为。另一台计算机配备 NeuView 软件，用于控制微型显微镜并记录 Ca²⁺ 图像
   1. 打开行为摄像软件（参见 材料表）以通过直播功能查看小鼠行为实验区域。手动调整顶部相机的焦距（图2L).
   2. 选择 触发/闪光 并检查“启用/禁用触发器" (图 3B）。单击 记录 按钮，使用 浏览 选择行为记录的保存位置，并选择所需的图像格式。
      注意： 启用“触发控制”功能，以允许 NeuView 软件触发行为记录，从而实现行为帧与相应钙成像帧在时间上的同步耦合。行为记录可保存为任意所需格式，通常以 JPEG 格式保存在指定文件夹中。
   3. 将小鼠靠近实验区域，并将微型显微镜连接到与数据采集系统相连的电缆图 2L）（参见 材料表然后将小鼠置于旷场的中央。
   4. 使用 NeuView 软件的实时流功能，调节 LED 功率以优化钙成像的亮度。
      注意： 钙成像的默认记录帧速率为10帧/秒。
   5. 在 NeuView 中，取消勾选 LED1，点击 捕获， 然后 触发 按钮以开始录制，然后按下 停止 100 帧之后。
      注意： 记录LED灯关闭时约100帧的背景图像。
   6. 在行为摄像软件中，单击 开始录制 (图3C）。在 NeuView 中检查 LED1，点击 捕获，然后 触发 开始录制的按钮。按下 停止 3000 帧之后。
      注意： 同时记录钙成像和行为。开放场实验持续15分钟，通常分为三个5分钟的记录阶段，以防止微型显微镜因连续使用而过热。
   7. 将钙成像和行为记录数据保存在指定文件夹中。在每次记录前记录背景值，再重复进行两次记录，将所有记录数据保存在指定文件夹中。

结果

图1：实验流程的示意图。 (A) 在 mPFC（内侧前额叶皮层）进行立体定位病毒注射。B在mPFC中植入GRIN（梯度折射率）透镜。C将微型显微镜基座固定到小鼠颅骨上。<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN透镜清洁剂
行为记录软件（Point Grey FlyCap2）	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	用于记录行为
数据采集控制器	NIDA/IRP	定制设计	图像采集系统的组件
数据传输电缆	NIDA/IRP	定制设计	图像采集系统的组件
GRIN透镜	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	用于GRIN透镜植入
微型显微镜底座	Protolabs	定制设计	用于安装底座
微型显微镜固定臂	NIDA/IRP	定制设计	用于安装底座
微型显微镜保护帽	Protolabs	定制设计	用于保护微型显微镜
电动控制器	Thorlabs	KMTS50E	用于安装底座
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	用于活体成像
眼科软膏	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	眼科用途
聚四氟乙烯（PTFE）胶带	TegaSeal PTFE Tape	A-A-58092	用于将微型显微镜固定到底座
无菌棉签	Puritan	REF 806-WC	用于两种手术