利用多光子延时成像技术观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞的迁移

摘要

来源：Williams, A. L., et al. 利用多光子延时成像技术实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移的神经嵴细胞的可视化. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了一种多光子延时成像方案，可用于高分辨率实时观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞的迁移过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 用于延时成像的显微镜设置

1. 确定激光参数

1. 确定所用激光波长。应使用等于目标荧光团激发波长两倍的波长（例如，对于绿色荧光蛋白（GFP），波长范围为 880 至 940 nm）。
注意： 在本研究中，GFP 的波长设置范围为 880 至 940 nm。波长越高，激光的输出功率越低。

2. 确定激光透射率。过高的激光透射率会杀死胚胎，应使用最低的透射水平（推荐做法）。对于本文所述的24至48小时的延时成像研究，透射率应保持在5%以下。

3. 确定显微镜检测系统，并确保为荧光染料安装了正确的滤光片。
注意： 对于多光子显微镜，存在多个具有不同发射荧光灵敏度的检测系统。通常情况下，内置检测系统的灵敏度低于外置检测系统。对于GFP表达水平较高的转基因品系，内置检测系统已足够。而对于GFP表达水平较低的转基因品系或其他荧光染料（例如，红色荧光蛋白），可能需要使用外置检测系统，以将激光透射率维持在合理水平。无论使用何种检测系统，都必须安装适用于该荧光染料的正确滤光片。

2. 调整多光子显微镜的软件设置

1. 使用5倍物镜定位胚胎。手动将载物台升至最高位置，并使用细调焦旋钮将胚胎置于显微镜视野的中央。

2. 手动降低载物台，将5X物镜更换为25X水浸物镜（数值孔径NA为0.95）。小心地升高载物台，使胚胎重新回到焦点位置。

3. 在软件中，点击“xyzt”模式，以在 x-y 平面内沿“z”深度方向按时间间隔（t）获取多张图像。使用落射荧光或明场模式观察目标区域的焦深，以确定 Z 层切的范围。

1. 在软件中，点击“begin”按钮；对于这些实验，以眼睛的侧缘作为Z轴堆栈的起始位置。点击“end”按钮；以胚胎的中线作为Z轴堆栈的终止位置。
注意： 步长为0.3–0.6 μm，Z轴堆栈总步数约为200步，堆栈范围为60至120 μm。

4. 单击菜单以调整采集时间和成像频率。
对于当前系统，每个z轴扫描序列的采集大约需要5分钟，共约200步。为了荧光探针的充分恢复以及胚胎的存活，z轴扫描采集（激光开启）与恢复时间（激光关闭）之间的比例应至少保持在1:3。
注意：例如，每20分钟采集一次z轴扫描序列，其中z轴扫描采集时间为5分钟，恢复时间为15分钟。在本实验方案中，可以获得更大的z轴扫描序列，但这将相应增加z轴扫描序列之间的间隔时间，导致延时成像过程中获得的图像数量减少。

1. 根据合适的胚胎回收时间，在指定窗口中设置z轴扫描间的时间间隔。在相应窗口中设置实验的总时长。

5. 最终的软件、激光和胚胎调整。

1. 打开实时成像设置，以对激光参数进行最后调整。在软件中调节激光透射率、增益和偏移滑块，以优化荧光图像。根据实验时长、胚胎预期生长情况等，必要时调整胚胎的方向。确保在实验过程中，目标区域始终位于视野范围内。

2. 关闭落射荧光光源，因为在延时成像过程中不再需要该光源。用激光安全箱覆盖载物台（图 1I）。当使用内置检测系统时，激光安全箱足以屏蔽背景光。按下“开始”按钮。
注意： 然而，对于更敏感的外部检测系统，激光安全箱无法充分阻挡背景光，需要额外的遮盖物以防止图像采集受到干扰。

2. 时间序列采集期间

1. 在延时成像过程中，通过激光安全箱上的滑动门，每8-12小时（每天至少2次）向开放式培养皿腔室补充延时胚胎培养液（图1I）。

2. 在打开激光安全箱的门之前，请确保显微镜未处于主动成像状态。
注意： 对于持续 24 至 48 小时的延时成像实验，无需使用加热器和循环培养基系统。实际上，载物台和管路加热器的温度均难以精确控制，而在成像过程中，胚胎在 25–28 °C 的温度范围内仍能保持良好的发育速率。此外，循环培养基系统容易发生溢出，可能损坏设备。因此，所有胚胎通常在成像结束后进行发育阶段的鉴定。

3. 采集后处理

1. 在软件中，单击“文件”菜单，然后选择“保存”。

2. 在图像处理软件中打开文件（参见材料表）。选中正确的图像序列。在软件中选择“Process”菜单，点击 3D Deconvolution 并点击“Apply”以对每个 z-stack 进行去卷积。
注意： 文件较大，因此此步骤可能需要数小时。

3. 在软件中，于“Process”菜单下点击“maximum projection”。点击“Apply”以执行最大投影，从而为每个z-stack生成一幅图像。将每个最大投影后的文件（每个z-stack一幅图像）导出为tiff格式。

4. 将单个 tiff 文件导入视频处理软件。选择所有 tiff 文件并将其拖入视频编辑器中。将视频中每幅图像的持续时间调整为 0.1 秒。将视频导出为 mov 或 mp4 文件。

结果

图1. 装置设置。A. 胚胎固定装置的各个组件，包括开放式浴槽室、快速交换平台和载物台适配器。B. 开放式浴槽室的组装。C. 将2%琼脂糖溶液（60–70 °C）加入开放式浴槽室中。D. 在荧光显...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
TC SP5 MP 多光子显微镜	Leica Microsystems CMS GmbH
Mai Tai DeepSee 钛宝石激光器	SpectraPhysics
激光安全防护箱	Leica Microsystems CMS GmbH
Leica Application Suite X (LAS X) 软件	Leica Microsystems CMS GmbH
Photoshop CS 6 版本 13.0 x64 软件	Adobe
iMovie 版本 10.1.4 软件	Apple
开放式浴槽腔室	Warner Instruments	RC-40HP	高型
快速交换平台	Warner Instruments	QE-1	35 mm
载物台适配器	Warner Instruments	SA-20LZ-AL	16.5 x 10 cm
低熔点琼脂糖	ISC Bioexpress	E-3112-25	GeneMate 筛网 GQA 低熔点琼脂糖，25 g
玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102	圆形盖玻片，直径 25 mm
高真空润滑脂	Fisher Scientific	14-635-5C	2.0 磅装管。DOW CORNING CORPORATION 1658832