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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. 延时成像的显微镜设置
1. 确定激光设置
1.确定要使用的激光波长。使用是目标荧光团激发波长两倍的波长（例如，绿色荧光蛋白 （GFP） 的波长在 880 到 940 nm 之间。
注意：在本研究中，GFP 的波长设置在 880 到 940 nm 之间。波长越高，激光器的输出功率越低。
2. 确定激光传输。高百分比的激光透射会杀死胚胎，使用最低的透射率（推荐）。对于 24 至 48 小时的延时研究，如本文所述，将透射率保持在 5% 以下。
3. 确定显微镜检测系统并确保为荧光团安装了正确的滤光片。
注意：对于多光子显微镜，有多个检测系统对发射的荧光具有不同的灵敏度。通常，内部检测系统的灵敏度低于外部检测系统。对于 GFP 表达水平高的转基因品系，内部检测系统就足够了。对于 GFP 表达水平低或具有其他荧光团（例如红色荧光蛋白）的转基因品系，可能需要外部检测系统以将激光透射率保持在合理水平。无论使用何种检测系统，都必须为荧光基团配备正确的滤光片。
2. 调整多光子显微镜上的软件设置
1.使用 5X 物镜，找到胚胎。手动将载物台升高到最高位置，并使用精细聚焦将胚胎定位在显微镜范围的中间。
2. 手动降低载物台，将 5 倍物镜更改为 25 倍水浸物镜（数值孔径 NA，0.95）。小心地抬高载物台，使胚胎重新聚焦。
3. 在软件中，单击"xyzt"模式，在 "z" 深度的 x-y 平面上以时间间隔 （t） 获取多张图像。使用落射荧光或明场视图找到感兴趣区域中的焦深，这将划分 Z 堆栈。
1. 在软件中，点击"开始"按钮;对于这些实验，眼睛的外侧边缘是 Z 轴堆栈的起点。点击"结束"按钮;胚胎的中线是 Z 堆栈的末端。
注意：步长为 0.3-0.6 μm，对于 60 至 120 μm 的 z 堆栈大小，总共有 ~200 个步骤）。
4. 点击菜单调整采集时间和成像频率。
对于目前的系统，每次 z-stack 采集需要大约 5 分钟才能完成 ~200 步。为了充分恢复荧光团和胚胎存活，允许 z 堆栈采集（激光开机）和恢复时间（激光关机）之间的比率至少为 1：3。
注意：例如，每 20 分钟采集一次 z 堆栈，其中 z 堆栈采集时间为 5 分钟，恢复时间为 15 分钟。对于此协议，可以获得更大的 z 堆栈，但会适当增加 z 堆栈采集之间的时间，从而导致在延时过程中的图像更少。
1. 在适当的胚胎恢复时间下，在指定窗口中设置 z 堆栈之间的时间。在相应的窗口中设置实验的总时间长度。
5. 最终软件、激光和胚胎调整。
1. 打开实时图像设置以对激光设置进行最终调整。在软件中调整激光透射、增益和偏移滑块以优化荧光图像。此外，根据需要调整胚胎的方向，具体取决于实验的长度、胚胎的预期生长等。确保感兴趣区域在整个实验期间保持在帧内。
2. 关闭落射荧光光源，因为在延时采集过程中不再需要它。用激光安全箱盖住载物台（图 1I）。使用内部检测系统时，激光安全箱足以抵御背景光。按"开始".
注意：但是，对于更灵敏的外部检测系统，激光安全箱无法阻挡足够的背景光，需要额外的盖子以防止干扰图像采集。
2. 在延时采集期间
1.在延时采集期间，通过激光安全箱上的滑动门每 8-12 小时（每天至少 2 次）用延时胚胎培养基重新填充开放的浴室（图 1I）。
2. 在打开激光安全箱的门之前，请确保显微镜没有主动获取图像。
注意：对于持续 24 至 48 小时的延时成像实验，无需使用加热器和循环介质系统。事实上，载物台和在线加热器的温度都难以控制，并且在图像采集过程中，胚胎在 25-28 °C 的温度范围内表现出足够的发育速度。此外，循环介质系统容易溢出并可能损坏设备。因此，所有胚胎在获得后都定期分期。
3. 采集后处理
< style='margin-left：40px;'>1.在软件中，单击"文件"菜单并选择"保存"。
2. 在图像处理软件中打开文件（参见材料表）。突出显示正确的图像序列。在软件中，选择 "Process" 菜单。单击 3D Deconvolution 并 "Apply" 对每个 z-stack.
注意：文件很大;因此，此步骤可能需要很多小时。
3. 在软件的 "Process" 菜单下，点击 "maximum projection"。单击"应用"以启动最大投影，以每个 z 堆栈生成 1 张图像。将每个最大投影文件（每个 z 堆栈 1 个图像）导出为 tiff。
4. 将单个 tiff 文件导入视频处理软件。选择所有 tiff 文件并将它们拖到视频编辑器中。将视频中每张图片的长度调整为 0.1 秒。将视频导出为 mov 或 mp4 文件。
