清醒大鼠中用于精确定位神经活动的紧密细胞记录与染色技术

摘要

来源：Moore, J. D., 等. 在清醒、头部固定的大鼠皮层下脑结构中对单个神经元进行细胞外邻近记录与定位. J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了在固定且清醒的大鼠中进行细胞外邻近记录与染色的方法。该过程包括记录神经元信号并注射染料，以精确定位记录位点。该技术可实现神经活动与脑解剖结构之间的精确对应。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 神经元单位的紧密细胞外监测

1. 使用二氧化碳激光微管拉制仪（见材料部分）拉制石英毛细管，使其尖端直径小于1 μm（图2A).
   注意： 加热参数将根据具体仪器而有所不同，所需颈部直径也会因目标脑区结构而异。在大鼠丘脑记录时，微电极的颈部长度范围为5-7 mm。
2. 将移液管固定在配有长工作距离物镜的微分干涉差显微镜下。使用建模用黏土将移液管固定在显微镜载物台上。
3. 缓慢地用移液管尖端将一块玻璃片（厚度为0.5–1 cm；使用超薄切片刀制作用的玻璃片较为方便）移入视野中。利用载物台微操作器，轻轻使移液管尖端接触玻璃片，使其断裂。重复此操作，直至移液管尖端外径达到1–3 μm（图2B、C）。确保这些微电极的阻抗在约5-15 MΩ之间。
4. 配制细胞外盐溶液（135 mM NaCl，5.4 mM KCl，1.8 mM CaCl₂）₂，1 mM MgCl₂，5 mM HEPES（4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸），用 NaOH 调节 pH 至 7.2），并加入 2%（w/v）芝加哥蓝。使用带有 30 G 或更小针头的注射器将溶液注入玻璃微电极后端。或者，对于单细胞近胞标记，可用 2%（w/v）神经生物素或生物素化葡聚糖胺（BDA-3000 或 BDA-10000）替代芝加哥蓝加入生理盐水中。
5. 将大鼠放入置于刚性管内的布袜中，并固定在合适的实验装置上 (图1）。手术后至少等待72小时，再将动物置于头部固定装置中。收紧束带时应围绕胸骨上部，而非颈部，以避免阻塞气道。若发现呼吸费力或受阻，应放松束带或将束带向后移动。此操作应在大鼠清醒状态下进行。
6. 将大鼠头部固定板连接到固定装置的对应部件上。操作时，先将头部固定板用销钉定位，再使用4-40螺钉将其固定。务必等待动物处于平静状态后再操作，以避免对头部施加过大的扭矩。接着，将一个8-32螺母安装到植入大鼠颅内的头部固定螺栓上，然后将一根带螺纹的不锈钢杆拧入该螺栓。将不锈钢杆固定到实验用固定装置上，确保其可被牢固锁紧（图1).
   注意： 使用头部固定螺栓和头颅固定板固定动物，可最大限度减少装置的弯曲，提高记录的稳定性。在大多数情况下，可在动物首次进行头颅固定当天开始记录。然而，若动物表现出过度扭动或发声，则应在开始任何记录前进行为期一天的头颅固定适应性训练。在此情况下，将动物置于固定装置上15分钟，随后放回笼中。次日重复此步骤，之后继续执行实验方案。
7. 打开记录室并移除硅胶。如果颅骨开窗处有组织再生，使用精细镊子清理。
8. 将移液管连接至电动显微操作器，并插入头级前置放大器。
   注意： 在本实验演示中，位于头部固定装置上的小型继电器电路可在放大器导线与具有高顺应性的外部电流源之间进行切换图3A-C）。请注意，某些放大器具有适当的内置高合规性电源。
9. 使用电动显微操作器将移液管尖端移至记录室中立体定位标记的位置。记录该位置的坐标。注意避免移液管尖端与颅骨发生碰撞而折断。
10. 将移液管移动至前-后轴和内-外侧轴上的目标记录位置。随后将移液管向腹侧推进，穿过硬脑膜，直至其位于目标记录位置背侧约500 μm处。
11. 缓慢推进移液管，同时监听移液管尖端与参考电极导线之间放大电压信号的音频监测器中的放电事件。一旦识别到放电事件，继续移动移液管0–100 μm，直至观察到幅度大于约500 μV的正向电压偏转。
    注意： 电极电阻将增加约1.5至10倍。
12. 一旦分离出神经元信号，应立即开始记录，并同步采集所有其他感兴趣的生理和行为指标。在本演示中，通过高速视频记录来自发的触须运动（参见 材料 部分）。
13. 为标记记录位点，切换电极导线以连接至电流源。实现此操作有多种方法，可使用继电器电路图 3A-C），放大器内置的电流源，或手动图 3D）以50%占空比、2秒脉冲、持续4分钟，施加-4 μA电流，通过移液管电泳注入芝加哥蓝。
14. 按照标准操作流程，在完成多次标记步骤后处死并灌注动物。切取脑组织，并根据需要进行复染，以确定记录位点的解剖学位置。对组织进行细胞色素氧化酶活性复染。或者，使用荧光显微镜鉴定芝加哥蓝染料沉积。
    注意： 为准确区分不同标记的单位，所有标记必须使用同一支移液器在同一天内完成，且在标记之间不得松开移液器。在此情况下，可通过事后组织学分析中各记录位点的相对位置，结合每个位点记录的操纵器坐标，来区分记录位点。为实现明确识别，标记之间的距离应至少相隔200 μm，每个脑区的标记数量不超过3至5个。

结果

图1：实验夹具。用于电生理和行为监测实验的大鼠机械夹具示意图。该夹具利用杆和板

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮盐酸盐（Ketaset）	Fort Dodge	N/A
阿奈赛（赛拉嗪溶液）	Lloyd Laboratories	N/A
聚维酮碘（Povidone-Iodine）	CVS 药房	269281
Loctite 495	格雷格工业供应公司	4KL86	20-40 cp 氰基丙烯酸酯
Vetbond	3M	1469SB
握力水泥粉	Dentsply Intl	675571	记录室的底部
握力水泥液	登士柏国际	675572	记录室的底部
硅凝胶	道康宁	3月-80
喷射型义齿修补丙烯酸粉末	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	用于将头部固定装置固定到颅骨上
Ortho-Jet 快速固化正畸用丙烯酸树脂液	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A	用于将头部固定装置固定到颅骨
芝加哥蓝	Sigma	C8679
多聚甲醛	Sigma	158127	用于灌注和组织固定
磷酸盐缓冲液	Sigma	P3813	用于灌注和组织固定
细胞色素C	Sigma	C2506
二氨基联苯胺	Sigma	D5905
大鼠袜套	Sew Elegant（加利福尼亚州圣地亚哥）	N/A
PVC 管 2 ½”	美国塑料公司	34108
微型 D 型针脚 & 插座	TE Connectivity	205089-1
直径0.010英寸不锈钢琴钢丝	Precision Brand Products, Inc.	21010
立体定位固定架	Kopf Instruments	Model 900
立体定位耳杆	Kopf Instruments	Model 957
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 960
½ mm 钻头磨头	Henry Schein	100-3995
静音型牙科钻机	中西部牙科	393-1600
不锈钢 0-80 1/8 英寸螺丝	紧固件超级商店	247438
0.2 mL 离心管	Fisher Scientific	05-407-8A
定制头部固定杆	加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间	N/A
直角术后夹	纽波特	MCA-1
8-32 3/4英寸螺钉	Fastener Superstore	240181
4-40 ¼英寸螺钉	紧固件超市	239958
石英毛细管	Sutter Instruments	QF-100-60-10
电动显微操作器	Sutter Instruments	MP-285
微电极放大器	Molecular Devices	Multiclamp 700B	替代部件：Molecular Devices Axoclamp 900A
微电极放大器探头级	Molecular Devices	CV-7B	替换部件：HS-9Ax10 与 Molecular Devices Axoclamp 900A 配合使用
独立脉冲刺激器	A-M Systems	Model 2100	替代部件：HS-9Ax10 与 Molecular Devices Axoclamp 900A 配合使用
音频监视器	Radio Shack	32-2040
电极导联线	导丝	NEF34-1646
放大器头级继电器	COTO Technology	#2342-05-000	（可选）与定制印刷电路板（UCSD Physics Electronics Shop）配合使用，见图6A-C
数码摄像机	巴斯勒	A602fm
移液器架	Warner Instruments	#MEW-F10T
定制头部固定板	加州大学圣地亚哥分校斯克里普斯海洋研究所机械车间	N/A