来源：Jeong, S. 在Drosophila中可视化胚胎运动神经元的轴突投射模式。J. Vis. Exp. (2017)
本视频展示了轴突投射的可视化方法 果蝇 胚胎。通过运动神经元的免疫标记、精确解剖以暴露神经结构，以及微分干涉差显微镜观察，可共同揭示详细的神经元结构，重点呈现轴突投射模式。
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方法文章
Drosophila 胚胎运动神经元轴突投射模式的可视化
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2025年6月17日
本文内容
摘要
方案
1. 准备
- 通过向500 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中加入0.5 g牛血清白蛋白（BSA）和0.5 mL t-辛基苯基聚乙二醇（PBT）（参见材料表），搅拌至少30分钟，配制500 mL含t-辛基苯基聚乙二醇的磷酸盐缓冲液（PBT）。4 °C保存。请使用较新鲜的溶液，并将溶液储存在洁净的瓶中。
- 通过将2.5 mL的16%储备液多聚甲醛和1 mL的10× PBS加入6.5 mL去离子水中，配制10 mL的4%多聚甲醛溶液。4 °C保存，一周内使用完毕。
注意：避免皮肤接触多聚甲醛溶液，因其具有高毒性。 - 通过将每1 mL二甲基亚砜（DMSO）中溶解0.1 g的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷（X-Gal）底物，配制10%（w/v）X-Gal底物溶液（X-Gal溶于DMSO）。分装为100 µL每份，-20 °C保存。
- 使用10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.2）、150 mM氯化钠（NaCl）、1 mM氯化镁（MgCl2）、3 mM亚铁氰化钾（K4[FeII(CN)6]）、3 mM铁氰化钾（K3[FeIII(CN)6]）和0.3% t-辛基苯基聚乙二醇配制X-Gal染色液。4 °C避光保存。
- 通过将30%储备液过氧化氢与去离子水按1:10稀释，配制3%过氧化氢溶液。
- 将1片（10 mg）3,3′-二氨基联苯胺（DAB）完全溶解于35 mL新鲜PBT溶液中，配制DAB溶液。使用0.2-µm注射器滤器过滤，分装为910 µL每份，-20 °C保存。
注意：所有DAB废弃物应使用漂白剂处理以彻底降解DAB。 - 制备含苹果汁的果蝇培养基平板。将35 g琼脂和1 L去离子水加入2 L锥形瓶中。另取1 L锥形瓶，加入33 g蔗糖、2 g丙酸钠（tegosept）和375 mL苹果汁。121 °C高压灭菌30分钟使其完全融化。待两溶液冷却至约60 °C后，充分混合搅拌。每60 mm培养皿中倒入约11 mL混合溶液。
- 将干酵母与去离子水按1:0.8比例混合搅拌，制成酵母糊，4 °C保存。
2. 胚胎采集（第1天）
- 收集年轻的雌性和雄性果蝇（日龄小于5天），并在塑料杯饲养笼中饲养1至2天，笼内放置一个卵板（60 mm × 15 mm），卵板中央含有少量酵母糊。
- 为最佳收集晚期16阶段的胚胎，于约下午5点将果蝇（> 50只）放入瓶状饲养笼中，在25 °C条件下让其产卵3小时。
- 将果蝇转移至新的食物培养瓶中。
- 用盖子盖好卵板，倒置后于25 °C、湿度约70%的湿润培养箱中过夜孵育。
3. 胚胎免疫染色前处理（第2天）
- 上午10:20左右，向卵板周围加入1.8 mL PBT溶液，并在倾斜卵板的同时用棉签轻轻搅动以使胚胎脱离板面。
注意： 用棉签轻轻碾压酵母糊，若发现其上附着大量胚胎，需将其溶解。在固定前约40分钟（约上午11:00）开始收集胚胎。 - 使用1 mL移液器吸头将胚胎从培养皿转移到1.5 mL离心管中。
- 让胚胎沉降，尽可能吸除PBT溶液。用1 mL PBT溶液清洗胚胎两次。每次均尽可能吸除PBT溶液。
- 用1 mL 50%的次氯酸钠溶液填充试管（即， 用去离子水稀释）后，在室温（RT）下于振荡器中孵育3分钟以去除胚胎的卵膜。
注意： 此步骤不会杀死去壳胚胎。 - 让去壳的胚胎沉降，尽可能吸除50%次氯酸钠溶液，并用1 mL PBT溶液清洗胚胎3次。
- 向试管中加入0.5 mL庚烷，随后在室温下于上午11:00左右加入0.5 mL 4%多聚甲醛溶液。
- 在室温下于旋转摇床中孵育胚胎15分钟。
- 移除4%多聚甲醛溶液（下层）。
- 加入0.5 mL 100%甲醇，通过剧烈振荡离心管30秒以去除胚胎的卵黄膜。
- 除去庚烷（即， 上层
- 加入0.5 mL 100%甲醇，剧烈振荡试管10秒。
- 轻敲离心管使胚胎沉降，尽可能吸除甲醇。用1 mL 100%甲醇冲洗胚胎，振荡时间少于10秒。
注意： 长时间暴露于甲醇会破坏β-半乳糖苷酶活性。 - 除去甲醇，并用1 mL PBT溶液将去卵黄胚胎冲洗3次。
4. 使用 LacZ 染色对胚胎进行基因分型（第 2 天）
- 向离心管中加入1 mL PBT溶液，将离心管置于37 °C的加热块或水浴中孵育15 min。
- 孵育期间，将X-Gal染色液（每管1 mL）置于65 °C水浴中加热至浑浊，随后转移至37 °C水浴中孵育。
- 吸去PBT溶液，向管中加入1 mL X-Gal染色液和20 µL X-Gal底物。
- 在37 °C下振荡孵育试管，直至出现蓝色沉淀。
注意： 第二次和第三次蓝色平衡剂的孵育时间通常为2-4小时。 - 移除X-Gal染色液，用1 mL室温PBT溶液将胚胎漂洗3次。
- 使用针探针或镊子，手动筛选所需基因型的胚胎（即， 使用体视显微镜（1.6X-2.5X物镜）观察未染色的白色胚胎。
注意： 由于某些蓝色平衡染色体，例如 CyO，actin-LacZ 和 TM3，肌动蛋白-LacZ，携带一个转基因构建体，该构建体在大肠杆菌β-半乳糖苷酶（LacZ）启动子的调控下表达细菌性β-Gal（LacZ） 肌动蛋白 启动子，以普遍方式染成蓝色的胚胎含有一份或两份蓝色平衡染色体。因此，未染色的白色胚胎对于目标致死等位基因为纯合子。
5. 使用抗Fasciclin II抗体对胚胎进行免疫染色（第2-3天）
- 收集并转移所需基因型的胚胎（即， 使用1 mL移液枪头将未染色的白色胚胎转移至0.5 mL微量离心管中。
注意： 在此步骤中，可根据形态学标准（包括表皮的分节模式以及头部和尾部的结构）对胚胎进行大致的分期。在卵子产出后10至16小时的头部内陷过程中，胚胎的前部节段会发生明显的收缩。 - 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎一次，加入 0.3 mL 封闭液（含 5% 正常山羊血清和 5% DMSO 的 PBT 溶液）。
- 在室温下将胚胎置于振荡器中封闭15分钟。
- 加入75 µL抗Fasciclin II抗体，室温下振荡孵育过夜。
- 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎，每次至少 20 分钟，共洗涤 4 次。
- 加入含0.3 mL封闭液（含5%正常山羊血清的PBT溶液），其中加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（anti-mouse-HRP）抗体（2 µg/mL），在室温下于旋转摇床上孵育过夜。
- 用0.4 mL PBT溶液清洗胚胎，每次至少20分钟，共清洗6次。
- 加入0.3 mL DAB溶液至试管中。
警告： 佩戴手套，并将所有DAB废液/管子/枪头放入漂白剂中。 - 加入2 µL 3%过氧化氢，在室温下避光孵育，同时轻轻振荡，直至产生所需量的沉淀。
注意： 1D4免疫组织化学的孵育时间通常为0.5至1小时。 - 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次。
警告： 移除 DAB 溶液及前两次洗涤液，用移液器吸取后弃入含漂白剂的废液容器中。 - 加入0.2 mL封片用70%甘油/PBS溶液至离心管中，于室温或4 °C保存。
注意： 将试管避光保存。通过将胚胎置于90%甘油/PBS溶液中，可获得更透明的样本。然而，与70%甘油/PBS溶液处理的胚胎相比，90%甘油/PBS溶液处理的胚胎更难进行解剖。
6. 胚胎的分期、解剖、封片与成像（第4天）
- 用于分期，将用70%甘油/PBS平衡的胚胎转移至载玻片上。
- 收集晚期16期胚胎，这些胚胎的第7腹节（A7）、A8和A9的节间神经（ISN）汇聚并相互接触，和/或中肠已分为三条带状结构。
注意：使用1D4抗体染色的胚胎可根据ISN和ISNb运动轴突的投射模式进行分期。晚期16期胚胎的A7、A8和A9 ISN神经在离开中枢神经系统（CNS）后汇聚并相互接触，随后分开并向背侧肌肉延伸（图1A中的箭头所示）。然而，在中期16期胚胎中，A7 ISN神经与A8/A9神经平行延伸（图1B中方括号所示）。此外，两侧体节中A6 ISNb神经的投射轴（垂直于腹外侧肌肉）大致与CNS纵向轴突束后端对齐（图1C中的箭头和直线所示）。这些形态学标准在不同基因型之间存在差异。另外，也可根据肠道形态对胚胎进行分期。在17期之前，中肠呈心形，而在17期时中肠被分为三条带状结构。 - 解剖胚胎。
- 使用1 mL注射器将每个胚胎从甘油液滴中移出，并将胚胎腹面朝上放置。在体长1/4处切断前部，并切除不含运动轴突的最尾端区域。
- 使用针状探针将切端后的胚胎从甘油液滴中移出，滚动胚胎使其背侧朝上，并水平放置于视野中。
注意：当胚胎从甘油液滴中移出时，附着在胚胎上的少量甘油会使其具有黏性。 - 使用一根极细的钨针沿背侧中线切开胚胎。先在胚胎尾端做一小切口，然后继续沿背侧中线向前切割；反向切割亦可。
- 使用针状探针将中线切开的胚胎移入甘油液滴中，使其背侧朝上，并通过将每侧体壁向腹外侧（对角线方向）展开的方式将肠道从体壁上分离（使用2.5X物镜）。
注意：确保背侧中线被完全切开，从而使左右体壁完全分离。 - 小心地将中线切开的胚胎从甘油液滴中移出，然后使用细针状探针将两侧体壁平铺在载玻片上（使用2.5X物镜）。
- 使用极细的钨针通过侧向推动的方式从解剖后的胚胎中去除内脏器官（使用5X物镜）。
注意：网站上可找到另一种类似解剖步骤的更详细描述。
- 封片时，在清洁的解剖胚胎上加入2–3 µL 70%甘油/PBS溶液，并使用细针状探针将其转移至新的载玻片上，该载玻片中央已预先铺有8 µL 70%甘油/PBS溶液（使用2.5X物镜）。
- 盖上盖玻片（18 mm × 18 mm）。使用普通指甲油（透明或有色均可）密封盖玻片边缘。
- 根据制造商说明，在微分干涉差（DIC）光学显微镜下以高分辨率（20X、40X和63X油浸物镜）采集图像。
注意：使用63X油浸物镜可获得更清晰的可视化效果和表型特征，尤其是对ISNb运动轴突的观察。
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结果
图1：基于ISN和ISNb运动轴突投射模式的胚胎分期。（A）在晚期16阶段的野生型胚胎中，A7、A8和A9的ISN神经（箭头）汇聚并相互接触（箭头指示交汇点）。头端朝左，腹面朝下。比例尺 = 15 µm。（B）在中期16阶段的野生型胚胎中，A7的ISN神经与A8/A9神经平行延伸（方括号...
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-辛基苯基聚氧乙烯醚 |
| 16% 甲醛溶液 | Ted Pella | 18505 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | 71500 | |
| X-Gal 底物 | US Biological | X1000 | X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷半乳吡喃糖苷） |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 三水合六氰合铁(II)酸钾 | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| 铁氰化钾(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
| 过氧化氢 | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| 3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐 | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| 琼脂 | US Biological | A0930 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | S5-3 | |
| Tegosept（对羟基苯甲酸甲酯） | Sigma-Aldrich | H5501 | |
| 培养皿（60 mm） | 康宁 | 430166 | |
| 三颈烧瓶 | Simport | B700-100 | 用于制作胚胎收集用的塑料烧杯笼。 |
| 酵母 | 莱莎弗工业公司 | Saf即发干酵母红色 | |
| 棉签（木柄单头棉签 PK100） | VWR | 14220-263 | |
| Eppendorf管（1.5 ml） | Sarstedt | #72.690 | |
| 漂白剂 | The Clorox Company | Clorox | |
| 庚烷 | Sigma-Aldrich | 246654 | |
| 甲醇 | J.T. Baker | UN1230 | |
| 正常山羊血清 | Life Technologies | 16210-064 | |
| 抗-fasciculinII 抗体 | 发育研究杂交瘤库 | 1D4 抗 Fasciclin II 抗体 | |
| 山羊抗小鼠-HRP 抗体 | 杰克逊免疫研究实验室 | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 片段山羊抗小鼠 IgG+IgM（H+L）（最小交叉反应：人、牛、马血清蛋白） |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| 载玻片 | Duran Group | 235501403 | |
| 盖玻片 | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
| 1 ml 注射器 | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
| 钨针 | Ted Pella | #27-11 | 钨丝， ø0.13毫米/6.1米（ø0.005英寸/20英尺 |
| 摆动式混匀仪（迷你摇床） | 韩国科学 | KO.VS-96TWS | 或者，BD Clay Adams 品牌旋转混匀仪（BD 421125） |
