果蝇胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化

Abstract

来源：Jeong， S. 果蝇胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化。J. Vis. Exp. （2017）

该视频演示了果蝇胚胎中轴突投影的可视化。运动神经元的免疫标记、精确解剖以暴露神经元结构以及差分干涉对比显微镜共同揭示了详细的神经元结构，强调了轴突投射模式。

Protocol

1. 制备

将

1. 0.5 g 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.5 mL 间辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（参见材料表）加入 500 mL 1X PBS 中，搅拌至少 30 分钟，制备 500 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 （PBT） 溶液。在 4 °C 下储存。在相对新鲜时使用，并将溶液储存在干净的瓶子中。
2. 向 6.5 mL 去离子水中加入 2.5 mL 16% 多聚甲醛储备液和 1 mL 10x PBS，制备 10 mL 4% 多聚甲醛。储存在 4 °C 下并在一周内使用。
   注意： 避免皮肤接触多聚甲醛溶液，因为它具有剧毒。
3. 通过每 1 mL DMSO 溶解 0.1 g X-Gal 底物，制备 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal） 底物（10% w/v X-Gal 在二甲基亚砜 （DMSO） 中）。在 -20 °C 下以 100 μL 等分试样储存。
4. 使用 10 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 7.2）、150 mM 氯化钠、NaCl、1 mM 氯化镁、MgCl₂、3 mM 亚铁氰化钾、K₄[FeII（CN）₆]、3 mM 铁氰化钾、K₃[FeIII（CN）₆] 和 0.3% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇制备 X-Gal 染色溶液。在 4 °C 避光中储存。
5. 用去离子水以 1：10 的比例稀释 30% 过氧化氢储备液，制成 3% 过氧化氢溶液。
6. 通过将 1 片 （10 mg） DAB 完全溶解在 35 mL 新鲜 PBT 溶液中，制成 3,3′-二氨基联苯胺 （DAB） 溶液。通过 0.2 μm 针式过滤器过滤，并在 -20 °C 下以 910 μL 等分试样储存。
   注意：将所有 DAB 废物用漂白剂处理以销毁 DAB。
7. 用苹果汁制作蛋盘。向 2 L 培养瓶中加入 35 g 琼脂和 1 L 去离子水。将 33 g 蔗糖、2 g tegosept 和 375 mL 苹果汁加入 1 L 培养瓶中。通过高压灭菌 30 分钟融化它们。让两种溶液冷却至 60 °C 左右。通过搅拌将这些溶液混合并充分混合。每 60 mm 培养皿倒入 ~11 mL 混合溶液。
8. 通过将面包酵母混合到去离子水中（1：0.8 比例）并储存在 4 °C 下来制作酵母糊。

2. 胚胎采集（第 1 天）

1. 收集年轻的雌性和雄性苍蝇（小于 5 天），并将它们保存在带有蛋板（60 毫米 x 15 毫米）的塑料烧杯笼中 1-2 天，蛋板（60 毫米 x 15 毫米）中心含有少量酵母糊。
2. 为了获得晚期 16 胚胎的最佳收集，在下午 5 点左右用果蝇 （> 50） 设置一个瓶笼，让它们在 25 °C 下产卵 3 小时。
3. 将果蝇转移到新鲜食品瓶中。
4. 盖上盖子盖上蛋板，并在 25 °C 的加湿培养箱（~70% 湿度）中倒置孵育过夜。

3. 胚胎免疫染色的准备（第 2 天）

1. 上午 10：20 左右向蛋盘中加入 1.8 mL PBT 溶液，并在倾斜盘子的同时用棉签将胚胎从盘子中松开。
   注意：用棉签轻轻捣碎酵母糊，将其溶解，以防在其上发现大量胚胎。在固定前 ~40 分钟（上午 11：00 左右）开始收集胚胎。
2. 使用 1 mL 移液器吸头将胚胎从蛋板转移到 1.5 mL 微管中。
3. 让胚胎安定下来并尽可能多地吸出 PBT 溶液。用 1 mL PBT 溶液冲洗胚胎两次。尽可能多地吸出 PBT 溶液。
4. 用 1 mL 的 50% 漂白剂（即在去离子水中稀释）填充试管，并通过在室温 （RT） 下在章动器上孵育胚胎 3 分钟来使胚胎去绒毛膜化。
   注意：此步骤不会杀死去绒毛膜的胚胎。
5. 让去绒毛膜的胚胎沉淀下来，尽可能吸出 50% 的漂白剂，然后用 1 mL PBT 溶液冲洗胚胎 3 次。
6. 在上午 11：00 左右，在 RT 上加入 0.5 mL 庚烷，然后向试管中加入 0.5 mL 4% 多聚甲醛溶液。
7. 在 RT 下将胚胎在章动器上孵育 15 分钟。
8. 去除 4% 多聚甲醛溶液（底层）。
9. 加入 0.5 mL 的 100% 甲醇，并通过剧烈摇动试管 30 秒使胚胎脱硫。
10. 去除庚烷（即顶层）。
11. 加入 0.5 mL 的 100% 甲醇，并剧烈摇动试管 10 秒。
12. 通过敲击管子让胚胎安定下来，并尽可能多地吸出甲醇。用 1 mL 100% 甲醇冲洗胚胎，摇晃不到 10 秒
    注意：长时间暴露于甲醇会破坏 β-Gal 活性。
13. 去除甲醇，用 1 mL PBT 溶液冲洗脱晶胚胎 3 次。

4.使用 LacZ 染色对胚胎进行基因分型（第 2 天）

1. 向试管中加入 1 mL PBT 溶液，并在 37 °C 加热块或水浴中孵育试管 15 分钟。
2. 孵育期间，将 X-Gal 染色溶液（每管 1 mL）置于 65 °C 的水浴中，直至变得浑浊。在 37 °C 水浴中孵育。
3. 吸出 PBT 溶液，向试管中加入 1 mL X-Gal 染色溶液和 20 μL X-Gal 底物。
4. 在 37 °C 下用章动孵育试管，直到出现明显的蓝色沉淀。
   注意：第 2 个和第 3 个蓝色平衡剂的孵育时间一般为 2-4 小时。
5. 取出 X-Gal 染色溶液，用 1 mL RT PBT 溶液冲洗胚胎 3 次。
6. 使用针探针或镊子，用光学解剖显微镜（1.6X-2.5X 物镜）手动分选所需基因型的胚胎（即未染色的白色胚胎）。
   注意：由于一些蓝色平衡剂，如 CyO、肌动蛋白-LacZ 和 TM3、肌动蛋白-LacZ，在肌动蛋白的控制下携带表达细菌 β-Gal （LacZ） 的转基因构建体启动子，以普遍存在的方式染成蓝色的胚胎包含一两个 Blue Balancer 染色体的拷贝。因此，未染色的白色胚胎是所需致死等位基因的纯合子。

5. 用抗束蛋白 II 抗体对胚胎进行免疫染色（第 2-3 天）

1. 使用 1 mL 移液器吸头收集所需基因型的胚胎（即未染色的白色胚胎）并将其转移到 0.5 mL 微管中。
   注意：在此步骤中，可以根据形态学标准对胚胎进行粗略分期，包括角质层的分割模式以及头部和尾部的结构。在头部退化期间，在产卵后 10 至 16 小时之间，胚胎的前段显着减少。
2. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎一次，并加入 0.3 mL 封闭液（5% 正常山羊血清和 5% DMSO 在 PBT 溶液中）。
3. 在 RT 下用章动封闭胚胎 15 分钟。
4. 加入 75 μL 抗 Fasciclin II 抗体，并在 RT 下用章动孵育试管过夜。
5. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次，每次洗涤至少 20 分钟。
6. 加入 0.3 mL 含有山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（抗小鼠 HRP）抗体 （2 μg/mL） 的封闭溶液（PBT 溶液中的 5% 正常山羊血清），并在 RT 下用章动孵育试管过夜。
7. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 6 次，每次洗涤至少 20 分钟。
8. 向试管中加入 0.3 mL DAB 溶液。
   注意：戴上手套，将所有 DAB 废物/试管/吸头放入漂白剂中。
9. 加入 2 μL 3% 过氧化氢，并在室温下避光孵育试管并进行章动，直到产生所需量的沉淀。
   注意：1D4 免疫组织化学的孵育时间一般为 0.5-1 小时。
10. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次。
    注意：用移液管去除 DAB 溶液和前两次洗涤液，然后用漂白剂丢弃。
11. 向试管中加入 0.2 mL 封固剂 70% 甘油/PBS 溶液，并在室温或 4 °C 下储存。
    注意：使试管避光。通过将胚胎置于 90% 甘油/PBS 溶液中，可以获得更清晰的制剂。然而，解剖在 90% 甘油/PBS 溶液中清除的胚胎比在 70% 甘油/PBS 溶液中清除的胚胎更难。

6. 胚胎分期、解剖、安装和成像（第 4 天）

1. 对于分期，将用 70% 甘油/PBS 平衡的胚胎转移到载玻片上。
2. 收集具有腹部节段 7 （A7）、A8 和 A9 节段间神经 （ISN） 神经会聚以相互接触或/并且中肠细分为三个带的晚期 16 胚胎。
   注意：用 1D4 抗体染色的胚胎可以根据 ISN 和 ISNb 运动轴突的投影模式进行分期。离开中枢神经系统 （CNS） 后，晚期 16 胚胎的 A7、A8 和 A9 ISN 神经会聚并相互接触，随后发散并延伸到远处到背肌（图 1A 中的箭头）。然而，在 16 中期胚胎中，A7 ISN 神经与 A8/A9 神经平行延伸（图 1B 中的方括号）。此外，两个半节中 A6 ISNb 神经（垂直于腹外侧肌肉）的投影轴与 CNS 纵向轴突束的后端大致对齐（图 1C 中的箭头和一条线）。这些形态学标准因不同的基因型而异。或者，可以根据肠道形态对胚胎进行分期。在第 17 阶段之前，中肠呈心形，而中肠在第 17 阶段被细分为三个波段。
3. 解剖胚胎。
   1. 使用 1 mL 注射器，将每个胚胎从甘油滴中移出，并将胚胎腹面朝上。切掉体长 1/4 处的前部和最后部，即没有运动轴突。
   2. 使用针状探针将末端切割的胚胎从甘油滴中移出，滚动使其背侧朝上，然后将其水平放置在田间中。
      注意：当胚胎从甘油滴中移出时，与胚胎相关的一点甘油会使其发粘。
   3. 使用一根非常细的钨针沿背中线切割胚胎。在胚胎的后端做一个小切口，然后继续向前切下背侧中线;向相反方向切割也很好。
   4. 使用针探针，将中线切割的胚胎移动到甘油滴中，将其背侧朝上放置，然后沿腹外侧（对角线）方向展开每个体壁（2.5X 物镜），将肠道与体壁分离。
      注意：确保背中线完全切割，从而使左右体壁完全分离。
   5. 小心地将中线切割的胚胎从甘油滴中移出，然后使用细针探针（2.5X 物镜）将体壁的两个瓣向下放在载玻片上。
   6. 使用非常细的钨针，通过横向推动解剖胚胎的内脏（5 倍物镜）从解剖的胚胎中取出内脏。
      注意：可以在网站上找到另一种类似解剖程序的更详细描述。
4. 封片时，将 2-3 μL 70% 甘油/PBS 溶液添加到清洁、解剖的胚胎中，然后使用细针探针将它们转移到新的载玻片上，该载玻片上铺有 8 μL 70% 甘油/PBS 溶液（2.5X 物镜）。
5. 盖上盖玻片 （18 mm x 18 mm）。用普通指甲油（透明或有色都可以）密封盖玻片的边缘。
6. 根据制造商的说明，在微分干涉对比 （DIC） 光学显微镜下以高分辨率（20X、40X 和 63X 油浸物镜）捕获图像。
   注意：使用 63X 油浸物镜可以产生更好的可视化和表型表征，特别是对于 ISNb 电机轴突。

Results

图 1：基于 ISN 和 ISNb 运动轴突的投影模式的胚胎分期。（A）在晚期 16 野生型胚胎中，A7、A8 和 A9 ISN 神经（箭头）会聚以相互接触（箭头）。前部左侧，腹侧向下。比例尺 = 15 μm。（B） 在 16 中期野生型胚胎中，A7 ISN 神经与 A8/A9 神经平行延伸（方括号）。箭头表示 A7、A8 和 A9 ISN 神经。前部左侧，腹侧向下。比例尺 = 15 μm。（C） 用 F...

Materials