果蝇胚胎运动神经元轴突投影模式的可视化

1. 制备

1. 0.5 g 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.5 mL 间辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（参见材料表）加入 500 mL 1X PBS 中，搅拌至少 30 分钟，制备 500 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇 （PBT） 溶液。在 4 °C 下储存。在相对新鲜时使用，并将溶液储存在干净的瓶子中。
2. 向 6.5 mL 去离子水中加入 2.5 mL 16% 多聚甲醛储备液和 1 mL 10x PBS，制备 10 mL 4% 多聚甲醛。储存在 4 °C 下并在一周内使用。
   注意： 避免皮肤接触多聚甲醛溶液，因为它具有剧毒。
3. 通过每 1 mL DMSO 溶解 0.1 g X-Gal 底物，制备 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal） 底物（10% w/v X-Gal 在二甲基亚砜 （DMSO） 中）。在 -20 °C 下以 100 μL 等分试样储存。
4. 使用 10 mM 磷酸盐缓冲液 （pH 7.2）、150 mM 氯化钠、NaCl、1 mM 氯化镁、MgCl₂、3 mM 亚铁氰化钾、K₄[FeII（CN）₆]、3 mM 铁氰化钾、K₃[FeIII（CN）₆] 和 0.3% t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇制备 X-Gal 染色溶液。在 4 °C 避光中储存。
5. 用去离子水以 1：10 的比例稀释 30% 过氧化氢储备液，制成 3% 过氧化氢溶液。
6. 通过将 1 片 （10 mg） DAB 完全溶解在 35 mL 新鲜 PBT 溶液中，制成 3,3′-二氨基联苯胺 （DAB） 溶液。通过 0.2 μm 针式过滤器过滤，并在 -20 °C 下以 910 μL 等分试样储存。
   注意：将所有 DAB 废物用漂白剂处理以销毁 DAB。
7. 用苹果汁制作蛋盘。向 2 L 培养瓶中加入 35 g 琼脂和 1 L 去离子水。将 33 g 蔗糖、2 g tegosept 和 375 mL 苹果汁加入 1 L 培养瓶中。通过高压灭菌 30 分钟融化它们。让两种溶液冷却至 60 °C 左右。通过搅拌将这些溶液混合并充分混合。每 60 mm 培养皿倒入 ~11 mL 混合溶液。
8. 通过将面包酵母混合到去离子水中（1：0.8 比例）并储存在 4 °C 下来制作酵母糊。

2. 胚胎采集（第 1 天）

1. 收集年轻的雌性和雄性苍蝇（小于 5 天），并将它们保存在带有蛋板（60 毫米 x 15 毫米）的塑料烧杯笼中 1-2 天，蛋板（60 毫米 x 15 毫米）中心含有少量酵母糊。
2. 为了获得晚期 16 胚胎的最佳收集，在下午 5 点左右用果蝇 （> 50） 设置一个瓶笼，让它们在 25 °C 下产卵 3 小时。
3. 将果蝇转移到新鲜食品瓶中。
4. 盖上盖子盖上蛋板，并在 25 °C 的加湿培养箱（~70% 湿度）中倒置孵育过夜。

3. 胚胎免疫染色的准备（第 2 天）

1. 上午 10：20 左右向蛋盘中加入 1.8 mL PBT 溶液，并在倾斜盘子的同时用棉签将胚胎从盘子中松开。
   注意：用棉签轻轻捣碎酵母糊，将其溶解，以防在其上发现大量胚胎。在固定前 ~40 分钟（上午 11：00 左右）开始收集胚胎。
2. 使用 1 mL 移液器吸头将胚胎从蛋板转移到 1.5 mL 微管中。
3. 让胚胎安定下来并尽可能多地吸出 PBT 溶液。用 1 mL PBT 溶液冲洗胚胎两次。尽可能多地吸出 PBT 溶液。
4. 用 1 mL 的 50% 漂白剂（即在去离子水中稀释）填充试管，并通过在室温 （RT） 下在章动器上孵育胚胎 3 分钟来使胚胎去绒毛膜化。
   注意：此步骤不会杀死去绒毛膜的胚胎。
5. 让去绒毛膜的胚胎沉淀下来，尽可能吸出 50% 的漂白剂，然后用 1 mL PBT 溶液冲洗胚胎 3 次。
6. 在上午 11：00 左右，在 RT 上加入 0.5 mL 庚烷，然后向试管中加入 0.5 mL 4% 多聚甲醛溶液。
7. 在 RT 下将胚胎在章动器上孵育 15 分钟。
8. 去除 4% 多聚甲醛溶液（底层）。
9. 加入 0.5 mL 的 100% 甲醇，并通过剧烈摇动试管 30 秒使胚胎脱硫。
10. 去除庚烷（即顶层）。
11. 加入 0.5 mL 的 100% 甲醇，并剧烈摇动试管 10 秒。
12. 通过敲击管子让胚胎安定下来，并尽可能多地吸出甲醇。用 1 mL 100% 甲醇冲洗胚胎，摇晃不到 10 秒
    注意：长时间暴露于甲醇会破坏 β-Gal 活性。
13. 去除甲醇，用 1 mL PBT 溶液冲洗脱晶胚胎 3 次。

4.使用 LacZ 染色对胚胎进行基因分型（第 2 天）

1. 向试管中加入 1 mL PBT 溶液，并在 37 °C 加热块或水浴中孵育试管 15 分钟。
2. 孵育期间，将 X-Gal 染色溶液（每管 1 mL）置于 65 °C 的水浴中，直至变得浑浊。在 37 °C 水浴中孵育。
3. 吸出 PBT 溶液，向试管中加入 1 mL X-Gal 染色溶液和 20 μL X-Gal 底物。
4. 在 37 °C 下用章动孵育试管，直到出现明显的蓝色沉淀。
   注意：第 2 个和第 3 个蓝色平衡剂的孵育时间一般为 2-4 小时。
5. 取出 X-Gal 染色溶液，用 1 mL RT PBT 溶液冲洗胚胎 3 次。
6. 使用针探针或镊子，用光学解剖显微镜（1.6X-2.5X 物镜）手动分选所需基因型的胚胎（即未染色的白色胚胎）。
   注意：由于一些蓝色平衡剂，如 CyO、肌动蛋白-LacZ 和 TM3、肌动蛋白-LacZ，在肌动蛋白的控制下携带表达细菌 β-Gal （LacZ） 的转基因构建体启动子，以普遍存在的方式染成蓝色的胚胎包含一两个 Blue Balancer 染色体的拷贝。因此，未染色的白色胚胎是所需致死等位基因的纯合子。

5. 用抗束蛋白 II 抗体对胚胎进行免疫染色（第 2-3 天）

1. 使用 1 mL 移液器吸头收集所需基因型的胚胎（即未染色的白色胚胎）并将其转移到 0.5 mL 微管中。
   注意：在此步骤中，可以根据形态学标准对胚胎进行粗略分期，包括角质层的分割模式以及头部和尾部的结构。在头部退化期间，在产卵后 10 至 16 小时之间，胚胎的前段显着减少。
2. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎一次，并加入 0.3 mL 封闭液（5% 正常山羊血清和 5% DMSO 在 PBT 溶液中）。
3. 在 RT 下用章动封闭胚胎 15 分钟。
4. 加入 75 μL 抗 Fasciclin II 抗体，并在 RT 下用章动孵育试管过夜。
5. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次，每次洗涤至少 20 分钟。
6. 加入 0.3 mL 含有山羊抗小鼠辣根过氧化物酶（抗小鼠 HRP）抗体 （2 μg/mL） 的封闭溶液（PBT 溶液中的 5% 正常山羊血清），并在 RT 下用章动孵育试管过夜。
7. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 6 次，每次洗涤至少 20 分钟。
8. 向试管中加入 0.3 mL DAB 溶液。
   注意：戴上手套，将所有 DAB 废物/试管/吸头放入漂白剂中。
9. 加入 2 μL 3% 过氧化氢，并在室温下避光孵育试管并进行章动，直到产生所需量的沉淀。
   注意：1D4 免疫组织化学的孵育时间一般为 0.5-1 小时。
10. 用 0.4 mL PBT 溶液洗涤胚胎 4 次。
    注意：用移液管去除 DAB 溶液和前两次洗涤液，然后用漂白剂丢弃。
11. 向试管中加入 0.2 mL 封固剂 70% 甘油/PBS 溶液，并在室温或 4 °C 下储存。
    注意：使试管避光。通过将胚胎置于 90% 甘油/PBS 溶液中，可以获得更清晰的制剂。然而，解剖在 90% 甘油/PBS 溶液中清除的胚胎比在 70% 甘油/PBS 溶液中清除的胚胎更难。

6. 胚胎分期、解剖、安装和成像（第 4 天）

1. 对于分期，将用 70% 甘油/PBS 平衡的胚胎转移到载玻片上。
2. 收集具有腹部节段 7 （A7）、A8 和 A9 节段间神经 （ISN） 神经会聚以相互接触或/并且中肠细分为三个带的晚期 16 胚胎。
   注意：用 1D4 抗体染色的胚胎可以根据 ISN 和 ISNb 运动轴突的投影模式进行分期。离开中枢神经系统 （CNS） 后，晚期 16 胚胎的 A7、A8 和 A9 ISN 神经会聚并相互接触，随后发散并延伸到远处到背肌（图 1A 中的箭头）。然而，在 16 中期胚胎中，A7 ISN 神经与 A8/A9 神经平行延伸（图 1B 中的方括号）。此外，两个半节中 A6 ISNb 神经（垂直于腹外侧肌肉）的投影轴与 CNS 纵向轴突束的后端大致对齐（图 1C 中的箭头和一条线）。这些形态学标准因不同的基因型而异。或者，可以根据肠道形态对胚胎进行分期。在第 17 阶段之前，中肠呈心形，而中肠在第 17 阶段被细分为三个波段。
3. 解剖胚胎。
   1. 使用 1 mL 注射器，将每个胚胎从甘油滴中移出，并将胚胎腹面朝上。切掉体长 1/4 处的前部和最后部，即没有运动轴突。
   2. 使用针状探针将末端切割的胚胎从甘油滴中移出，滚动使其背侧朝上，然后将其水平放置在田间中。
      注意：当胚胎从甘油滴中移出时，与胚胎相关的一点甘油会使其发粘。
   3. 使用一根非常细的钨针沿背中线切割胚胎。在胚胎的后端做一个小切口，然后继续向前切下背侧中线;向相反方向切割也很好。
   4. 使用针探针，将中线切割的胚胎移动到甘油滴中，将其背侧朝上放置，然后沿腹外侧（对角线）方向展开每个体壁（2.5X 物镜），将肠道与体壁分离。
      注意：确保背中线完全切割，从而使左右体壁完全分离。
   5. 小心地将中线切割的胚胎从甘油滴中移出，然后使用细针探针（2.5X 物镜）将体壁的两个瓣向下放在载玻片上。
   6. 使用非常细的钨针，通过横向推动解剖胚胎的内脏（5 倍物镜）从解剖的胚胎中取出内脏。
      注意：可以在网站上找到另一种类似解剖程序的更详细描述。
4. 封片时，将 2-3 μL 70% 甘油/PBS 溶液添加到清洁、解剖的胚胎中，然后使用细针探针将它们转移到新的载玻片上，该载玻片上铺有 8 μL 70% 甘油/PBS 溶液（2.5X 物镜）。
5. 盖上盖玻片 （18 mm x 18 mm）。用普通指甲油（透明或有色都可以）密封盖玻片的边缘。
6. 根据制造商的说明，在微分干涉对比 （DIC） 光学显微镜下以高分辨率（20X、40X 和 63X 油浸物镜）捕获图像。
   注意：使用 63X 油浸物镜可以产生更好的可视化和表型表征，特别是对于 ISNb 电机轴突。

图 1：基于 ISN 和 ISNb 运动轴突的投影模式的胚胎分期。（A）在晚期 16 野生型胚胎中，A7、A8 和 A9 ISN 神经（箭头）会聚以相互接触（箭头）。前部左侧，腹侧向下。比例尺 = 15 μm。（B） 在 16 中期野生型胚胎中，A7 ISN 神经与 A8/A9 神经平行延伸（方括号）。箭头表示 A7、A8 和 A9 ISN 神经。前部左侧，腹侧向下。比例尺 = 15 μm。（C） 用 FasII 抗体染色的晚期 16 野生型胚胎的切片制备。左右 A6 ISNb 神经的投影轴（箭头）与 CNS 纵向轴突束（黑线）的后端大致对齐。腹部节段 A1-A7 在顶部标记。前部是左的。比例尺 = 15 μm.