活体成像斑马鱼幼体大脑以可视化小脑神经元

摘要

来源：Schramm, P. et al. 通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼体和稚鱼全脑组织的活体成像. J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在表达浦肯野神经元荧光蛋白的转基因斑马鱼幼体中进行的小脑神经元活体成像。该过程包括对幼体进行麻醉，将其固定于琼脂糖中，并小心去除色素化的皮肤以增强光穿透性和荧光强度。最后，将制备好的样本置于共聚焦显微镜下成像，以清晰观察标记的神经元。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 幼体麻醉及包埋前准备
   1. 开始当天实验时，使用塑料巴氏吸管将所需动物转移至一个直径为90 mm的培养皿中，该培养皿内装有Danieau溶液（适用于仍保存在Danieau溶液中的幼体）或鱼房用水（适用于受精后7天以上[dpf]、饲养在鱼房中的幼体）。
      1. 当转移超过2周龄的鱼时，确保吸管开口足够大，以避免在转移过程中损伤鱼体。切勿使用网具，因其会造成物理损伤，尤其是对较年轻的幼体。
   2. 在培养皿中添加适合幼体大小的rotifera或artemia无节幼体，以确保幼体自由摄食、保持最佳健康状态并减少应激。
   3. 为进行包埋，将选定的幼体转移至一个直径为35 mm、盛有人工脑脊液（ACSF）的培养皿中。加入适量d-Tubocurarine，使其工作浓度/有效剂量达到10 µM，并等待数分钟，直至幼体完全不动。
      注意： 当鱼体年龄增长或需要更快实现完全麻醉（5分钟内）时，可提高d-Tubocurarine的浓度（小鼠静脉注射LD50为0.13 mg/kg）。也可选用其他麻醉剂，如α-bungarotoxin（工作浓度：1 mg/mL），其作用与箭毒相同，且能保持大脑完全活跃。若实验目的无需完全活跃的大脑，可使用非致死剂量的Tricaine（0.02%）完全麻醉幼体，但Tricaine会阻断钠通道，从而抑制脑活动。
   4. 准备固定用培养皿：取一个直径为35 mm的培养皿的盖子，将其倒置，然后将一块方形玻璃盖玻片（24 × 24 mm）放置于盖子底部。参见图1（上部）以了解这些步骤的示意图。玻璃表面更光滑，可防止在开颅过程中含有幼体的琼脂糖块滑动。
   5. 将当天所需量的ACSF分装至合适的容器中（例如50 mL离心管、烧杯、Schott瓶等），并用碳合气（5% CO₂，95% O₂）进行氧合。若仅对形态学成像（例如荧光模式），仍需使用ACSF以维持脑组织完整性并避免渗透压效应对细胞产生负面影响，但无需对ACSF进行氧合。此步骤仅在需要全脑活动成像时才执行。
      注意： 为实现培养基的最佳氧饱和度，可在碳合气管末端连接一个气石。为确保足够高的氧含量，需根据成像室中包埋幼体的数量和年龄，每20–60分钟更换一次成像室中的ACSF，代之以新鲜氧合的ACSF（例如，单个包埋幼体每小时更换一次即可；若同时包埋6条以上14 dpf的幼体，则需每20分钟更换一次）。请根据实验计划合理估算所需氧合ACSF的总量。
2. 幼体包埋
   1. 使用塑料巴氏吸管将完全麻醉的幼体转移至（步骤1.4中）已准备好的固定用培养皿中。随后小心去除多余液体，以避免低熔点（LM）琼脂糖被稀释。所有后续操作均应在具有足够放大倍数的体视显微镜下进行。
      注意： 倾斜固定用培养皿有助于彻底去除液体。
   2. 立即进行下一步操作：在幼体上方滴加足量的LM琼脂糖液滴（约1 mL，视幼体大小而定），以防止动物干燥并减少不必要的应激。
   3. 在琼脂糖凝固前调整幼体位置，确保幼体背侧朝上。同时，应尽可能将幼体包埋在琼脂糖表面附近。
      注意： 根据计划同时包埋的幼体大小和数量，可调整琼脂糖浓度。例如，对于1–3条30 dpf的幼体，推荐使用1.8%–2%的LM琼脂糖；对于1–4条7 dpf的幼体，最适宜使用2.5%的LM琼脂糖；而对于5–8条幼体，则2%更为合适。若实验需要全脑保持活跃，建议每次仅包埋三条鱼，以缩短后续手术所需时间。总体而言，幼体年龄越大或同时包埋数量越多，越推荐使用较低浓度（1.8%–2%）的琼脂糖。
   4. 若使用倒置显微镜进行成像，需将含有幼体的琼脂糖块修剪成小长方体形状，以便后续将幼体转移至成像室。若使用正置显微镜，则无需修剪，因固定用培养皿也可直接作为成像室使用。参见图1（上部）以了解这些步骤的示意图。
3. 暴露大脑
   注意： 所有后续操作均需极为小心，避免对幼体造成不必要的损伤。若实验需要大脑完全活跃，请注意：每当鱼体仍完全包埋在琼脂糖中且颅骨已打开但未接触氧合ACSF时，每过一秒，大脑都会因缺氧和干燥而受损。这种缺氧效应在包埋的幼体年龄越大时越显著。因此，手术不仅应在尽可能短的时间内完成，还需具备最大精确度，以避免针头造成机械性脑损伤。经过训练后，步骤3.2–3.4每条鱼不应超过30秒。
4. 一旦琼脂糖凝固，立即开始手术。首先，切除脑部目标区域上方所有多余的琼脂糖，以获得对头部的自由操作空间。若头部背侧已部分露出琼脂糖表面，可跳过此步骤。
5. 根据目标脑区选择起始位置。使用玻璃针在皮肤上做一小切口，注意不要过深刺入组织。此切口将作为剥离覆盖皮肤的起点。
   注意： 为获得最佳效果，切勿直接在目标区域正上方开始操作，以降低损伤重要结构的风险。如有必要，可从后脑后方开始，向前推进，直至将不需要的皮肤区域完全剥离。
6. 沿皮肤继续进行微小切割，目标是仅在表层下方轻微移动针头即可去除皮肤。通常无需围绕整个脑部完全切割一圈，也不必切除圆形皮肤和颅骨，而只需沿头部两侧做两条切口，然后将皮肤推向一侧或另一侧即可。图2展示了为暴露小脑而进行最佳切割策略的示意图。
   注意： 此项显微手术操作精细，通常需要一定训练才能在不损伤下层脑组织的情况下完美去除皮肤。建议针对目标脑区确定最佳切割策略，并在整个实验过程中保持一致。
7. 在所有包埋幼体的皮肤去除后，立即倾倒（氧合）ACSF覆盖琼脂糖，以冲走残留的皮肤碎片和血液，维持大脑完全活跃状态，并防止其干燥。
   注意： 若实验需要健康的脑组织，建议每次最多处理三条鱼。
8. 若使用正置显微镜，可直接开始成像。
   1. 若使用倒置显微镜，用一小刮铲从长方体琼脂糖块下方轻轻插入（步骤2.4）。
   2. 在成像室（例如玻璃底培养皿）底部滴加少量LM琼脂糖液滴，立即用刮铲将含幼体的琼脂糖块翻转180°，并轻轻压入成像室底部，此时液态琼脂糖起到粘合剂作用。
   3. 待琼脂糖凝固后，向成像室中加入（氧合）ACSF，随后开始成像。参见图1（下部）以了解示意图。
9. 当实验需要全脑保持活跃时，务必确保成像室中ACSF的氧含量足够高。为此，应根据鱼的数量和大小、成像室的尺寸与表面积以及成像时长，每20–60分钟小心更换一次新鲜氧合的ACSF。

结果

图1：制备开颅斑马鱼用于活体成像的分步示意图。in vivo成像的逐步操作流程。 各步骤的工作说明可在图中找到。该图由Florian Hetsch设计，Paul Schramm改编。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
共聚焦激光扫描显微镜	Leica	TCS SP8
d-筒箭毒碱	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
玻璃毛细管类型1	WPI	1B150F-4
玻璃毛细管类型2	Harvard Apparatus	GC100F-10
玻璃盖玻片	deltalab	D102424
成像培养皿	Ibidi	81156
LM-琼脂糖	Condalab	8050.55
显微镜相机	Leica	DFC9000 GTC
针头拉制仪类型1	NARISHIGE	Model PC-10
针头拉制仪类型2	Sutter Instruments	Model P-2000
巴斯德移液管 3ml	A.Hartenstein	20170718
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521-50G
35 mm 培养皿	Sarstedt	833900
90 mm 培养皿	Sarstedt	821473001