利用原子力显微镜表征小鼠脑组织的机械特性

来源：Canovic, E. P., et al. 利用原子力显微镜、冲击压痕和流变学表征脑组织的多尺度力学特性。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了使用原子力显微镜（AFM）测量脑组织黏弹性特性的方法，其中带有球形探针的悬臂与组织相互作用，并在施加的力作用下发生弯曲。通过将激光束偏转至检测器上，追踪悬臂的运动以测量压痕深度和力松弛，从而实现对组织力学特性的表征。

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 原子力显微镜（AFM）介导的压痕法

根据制造商的说明，使用贻贝来源的生物粘合剂制备直径为60 mm的培养皿（P60）。
1. 制备中性缓冲液储备液，成分为0.1 M碳酸氢钠溶于无菌水中，最佳pH值为8.0。使用0.2微米滤膜过滤除菌，并于4 °C保存。
2. 在超净工作台内，将6.25%贻贝来源的生物粘合剂溶液与3.125%氢氧化钠（NaOH）溶于碳酸氢钠缓冲液中混合。
3. 用移液器吸取100 μl生物粘合剂溶液滴加至一个直径60 mm的培养皿（P60）中，并用移液器吸头将溶液均匀涂布成直径3–5 cm的圆形区域。
4. 将P60培养皿敞口置于超净工作台中，使其自然干燥（约30分钟）。随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，再用无菌水洗涤2次。让培养皿在超净工作台中空气干燥，并密封于塑料袋中，于4 °C保存，最长可保存1个月。
校准原子力显微镜（AFM）并安装脑组织样本。注意：请遵循制造商提供的AFM校准说明。
1. 小心地将标称弹簧常数为0.03 N/m、末端带有直径20 μm硼硅酸盐微球的AFM探针装入探针夹持器中。
2. 使用热调谐法校准AFM悬臂梁的弹簧常数和逆光学杠杆灵敏度（InvOLS）。
  注意：一旦计算出AFM探针的弹簧常数，在重复使用过程中应保持不变。然而，每次激光重新对准悬臂梁时，都需要重新校准悬臂梁的InvOLS。此外，校准应在比悬臂梁刚度高几个数量级的基底上进行，例如聚苯乙烯。
3. 打开载物台加热装置，并将温度设定为37 °C。
4. 将脑切片安装到P60培养皿中。
  1. 轻轻将厚350 μm的脑切片及含二氧化碳（CO₂）非依赖性培养基从圆底烧瓶转移至涂有贻贝来源生物粘合剂的P60培养皿中。
  2. 通过轻微倾斜培养皿，将脑切片置于P60培养皿中央。如有必要，可缓慢使用手动移液器吸取培养基，以展开折叠的脑切片；更佳做法是直接将脑切片准确放置于培养皿中央。
  3. 使用P1000移液器小心吸除多余培养基（切勿使用真空抽吸）。
  4. 盖上培养皿盖，使脑切片黏附20分钟。
5. 取下AFM探头，将装有脑切片的P60培养皿置于AFM载物台上，并加入约2 ml预热的CO₂非依赖性培养基。
6. 小心地在AFM探针上滴加一滴培养基，以防止探针在浸入脑切片周围液体时因表面张力而断裂。
7. 将AFM探头重新安装至载物台上，并缓慢下降探头直至其完全浸入液体中。
8. 利用AFM顶部的电荷耦合器件（CCD）相机，重新调整激光在悬臂梁上的位置。
  注意：由于空气与液体介质折射率不同，激光在悬臂梁上的对准位置会发生轻微变化。
9. 等待5分钟，使悬臂梁适应浸没在温热液体中的状态，然后将镜片对准重置为自由偏转0 V。
10. 根据制造商说明，在AFM软件中运行AFM探针的热谱图。利用第一热峰的拟合结果，重新计算AFM探针在液体介质中的InvOLS。
11. 使用光学显微镜移动样品载物台，使目标脑区位于AFM探针正下方。注意：胼胝体因比周围灰质更不透明而呈现较暗外观。皮层位于胼胝体上方。
12. 将镜片对准重置为自由偏转0 V。
13. 在AFM软件的“总和与偏转仪”界面中，点击“Engage”以启动AFM探头。
14. 通过AFM探头上的位置调节旋钮，缓慢下降探头，直至悬臂梁与样品接触。
进行蠕变柔量实验。
1. 在软件的功能编辑器中构建施加力函数。该力函数包括：0.1秒内从0升至5 nN的目标力，保持20秒，随后在1秒内下降至0 nN。
  1. 在压痕主控面板中，压痕方法下选择“Load”作为压头模式，单位选择“N”，压头函数选择“Function editor”。
  2. 在功能编辑器的“Segment Parms Panel”中，创建一个起始为0 nN、终止为5 nN、持续时间为0.1秒的施加力函数段。点击“Insert -->”。
  3. 对于下一段，设置起始和终止均为5 nN，时间为20秒。点击“Insert -->”。
  4. 对于最后一段，设置起始为5 nN，终止为0 nN，时间为1秒。然后点击“Draw”，并关闭功能编辑器窗口。
2. 在主控面板的“Force Tab”中，勾选“indenter ramp after trigger”，并将施加力函数设置为在达到0.1 V触发电平时启动。
3. 点击主控面板“Force Tab”底部的“Single Force”，以触发所构建的施加力函数，进行蠕变柔量测量。
4. 单次力压痕完成后，升起AFM探头使其脱离样品接触。然后重新启动探头并重新将自由偏转归零。
5. 移动样品载物台以定位新的感兴趣区域，并降低AFM探头使其与样品接触。注意：移动样品载物台时，必须先将AFM探头从样品表面收回。否则可能导致精密的AFM悬臂梁损坏。
6. 重复上述步骤，直至获得所需数量的数据。
进行力松弛实验。
1. 在软件的功能编辑器中构建施加压痕函数。该压痕函数包括：0.1秒内从0升至3 μm的目标压入深度，保持20秒，随后在1秒内下降至0 μm压入深度。
  1. 在压痕主控面板中，压痕方法下选择“Indentation”作为压头模式，单位选择“m”，压头函数选择“Function editor”。
  2. 在功能编辑器的“Segment Parms Panel”中，创建一个起始为0 μm、终止为3 μm、持续时间为0.1秒的施加压痕函数段。点击“Insert -->”。
  3. 对于下一段，设置起始和终止均为3 μm，时间为20秒。点击“Insert -->”。
  4. 对于最后一段，设置起始为3 μm，终止为0 μm，时间为1秒。然后点击“Draw”，并关闭功能编辑器窗口。
2. 在主控面板的“Force Tab”中，勾选“indenter ramp after trigger”，并将施加压痕函数设置为在达到0.1 V触发电平时启动。
3. 点击主控面板“Force Tab”底部的“Single Force”，以触发所构建的施加压痕函数，进行力松弛测量。
4. 单次压痕完成后，升起AFM探头使其脱离样品接触，然后重新启动探头并重新将偏转归零。
5. 移动载物台以定位新的感兴趣区域，并降低探头使其与样品接触。
6. 重复上述两种测量，直至获得所需数量的数据。

姓名	公司	目录编号	评论
Hibernate-A 培养基	Gibco	A1247501	适用于成体组织的 CO₂-非依赖性神经培养基
原子力显微镜，MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
培养皿加热器	Asylum Research	-
原子力显微镜探针，0.03 N/m，10 µm 半径硼硅酸盐玻璃微球	Novascan	PT.GS
Cell-Tak	Corning	354240	来源于贻贝的生物粘附剂
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	可使用其他供应商
氢氧化钠，1 N	Sigma-Aldrich	59223C	可使用其他供应商

利用原子力显微镜表征小鼠脑组织的机械特性

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