使用原子力显微镜表征小鼠脑组织的机械性能

Abstract

资料来源：Canovic， E. P.， et al。使用原子力显微镜、冲击压痕和流变测量表征脑组织的多尺度机械特性。J. Vis. Exp. （2016）

该视频演示了如何使用原子力显微镜（AFM）来测量脑组织的粘弹性，其中带有球形探针的悬臂与组织相互作用并在施加的力下弯曲。偏转到检测器上的激光束跟踪悬臂以测量压痕深度和力松弛，从而可以表征组织的机械特性。

Protocol

所有涉及动物样本的程序均已由适当的动物伦理审查委员会审查和批准。

1. 启用原子力显微镜 （AFM） 的压痕

1. 根据制造商的说明，用贻贝衍生的生物粘合剂准备直径为 60 毫米的培养皿 （P60）。
   1. 制备由 0.1 M 碳酸氢钠在无菌水中组成的中性缓冲溶液储备液，最佳 pH 值为 8.0。过滤灭菌（0.2 微米）碳酸氢钠缓冲液并将其储存在 4 °C。
   2. 在层流罩中，将 6.25% 贻贝衍生生物粘合剂和 3.125% 氢氧化钠 （NaOH） 的溶液在碳酸氢钠缓冲液中混合。
   3. 将 100 μl 生物粘合剂溶液移液到直径为 60 mm 的培养皿 （P60） 培养皿上，并使用移液器吸头将溶液涂抹成直径为 3-5 cm 的圆圈。
   4. 将 P60 培养皿未覆盖在层流罩中，让溶液干燥（~30 分钟）。用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗盘子 1 次，用无菌水清洗 2 次。让餐具在层流罩中风干，并将其存放在 4 °C 的密封塑料袋中长达 1 个月。
2. 校准 AFM 并在 AFM 中设置大脑样本。注意： 按照制造商的 AFM 校准说明进行作。
   1. 小心地将标称弹簧常数为 0.03 N/m 的 AFM 探针和直径为 20 μm 的硼硅酸盐珠子装入探针支架中。
   2. 使用热调谐方法校准悬臂的弹簧常数和逆光学杠杆灵敏度 （InvOLS）。
      注： 一旦计算出 AFM 探针的弹簧常数，它应该在重复使用时保持不变。但是，每次将激光器与悬臂重新对准时，都需要重新校准悬臂式 InvOLS。此外，应针对比悬臂硬几个数量级的基材（例如聚苯乙烯）进行校准。
   3. 打开载物台加热器，将温度设置为 37 °C。
   4. 将脑切片安装到 P60 培养皿上。
      1. 将 350 μm 厚的脑切片和圆底培养瓶中不依赖二氧化碳 （CO₂） 的培养基轻轻倒入涂有贻贝衍生生物粘合剂的 P60 培养皿中。
      2. 轻轻倾斜，将脑切片放在 P60 培养皿的中心。如有必要，从手动移液器中缓慢移液培养基，以展开已自行折叠的脑切片，或者更好的是，将脑切片放置在培养皿的中心。
      3. 使用 P1000 移液器小心去除多余的培养基（请勿使用真空吸尘器）。
      4. 盖上盖子在 P60 培养皿上，让脑切片粘附 20 分钟。
   5. 取下 AFM 头，将安装在 P60 培养皿中的脑切片放在 AFM 载物台上，加入 ~2 ml 预热的 CO₂ 独立培养基。
   6. 小心地将一滴介质添加到 AFM 探针上，以防止其在下降到脑切片周围的介质中时因表面张力而破裂。
   7. 将 AFM 头重新定位到载物台上并开始降低头，直到它浸入介质中。
   8. 使用俯视电荷耦合器件 （CCD） 相机，将激光器重新定位到悬臂上。
      注： 由于空气和介质的折射率不同，激光器在悬臂上的对准会略有变化。
   9. 等待 5 分钟，让悬臂适应浸没在温暖的液体中，然后将镜子对准重置为 0 V.
   10. 根据制造商的说明在 AFM 探针上运行热谱。使用第一个热峰的拟合来重新计算 AFM 探针在介质中的 InvOLS。
   11. 使用光学显微镜，移动样品台，使感兴趣的大脑区域位于 AFM 探针下方。注： 胼胝体会显得很暗，因为它比周围的灰质更不透明。皮层优于胼胝体。
   12. 将反射镜对准重置为 0 V.
   13. 在 AFM 软件的 Sum and Deflection Meter 上，单击"Engage"以接合 AFM 头。
   14. 使用 AFM 头上的位置刻度盘，降低头，直到悬臂和样品之间接触。
3. 进行蠕变柔度实验。
   1. 在软件的函数编辑器中构造一个施加的力函数。力函数包括 0.1 秒的斜坡到 5 nN 的设定点并保持 20 秒，然后 1 秒的斜坡下降到 0 nN 的施加力。
      1. 在"压痕主面板"的压痕方法下，为"压头模式"选择"加载"，为单位选择"N"，为压头功能选择"函数编辑器"。
      2. 在函数编辑器的 Segment Parms Panel（线段参数面板）上，创建一个从 0 nN 开始到 5 nN 结束的施加的力函数线段，时间为 0.1 秒。单击"Insert -->（插入 --）。
      3. 对于下一个片段，将开始设置为 5 nN，结束设置为 5 nN，并将时间设置为 20 秒。单击"Insert -->"。
      4. 对于最后一个段落，将 start 设置为 5 nN，将 end 设置为 0 nN，并将 time 设置为 1 sec。然后，单击 "Draw" 并关闭 Function Editor 窗口。
   2. 在主面板的力选项卡上，勾选"触发后压头斜坡"，并设置施加的力函数在达到 0.1 V.
   3. 的触发点后触发。点击主面板的力选项卡底部的"单力"，将触发构造施加的力函数，以实现蠕变柔度。
   4. 单力压痕完成后，抬起 AFM 头，使其不与样品接触。然后，重新接合头部并重新归零自由偏转。
   5. 重新定位样品台以找到新的感兴趣区域，并降低 AFM 头以进行接触。注： 当样品台移动时，AFM 头必须从样品表面缩回。否则可能会导致精密的 AFM 悬臂损坏。
   6. 重复这些步骤，直到收集到所需的数据量。
4. 进行力松弛实验。
   1. 在软件的函数编辑器中构造一个应用的缩进函数。压痕功能包括 0.1 秒的斜坡上升到 3 μm 的设定点并保持 20 秒，然后 1 秒的斜坡下降到 0 μm 的压痕深度。
      1. 在压痕主面板上，在压痕方法下，为压痕模式选择"压痕"， "m" 表示单位，"Function editor" 表示压头函数。
      2. 在函数编辑器的 Segment Parms 面板上，创建一个从 0 μm 开始到 3 μm 结束的施加力函数段，时间为 0.1 秒。单击"Insert -->"。
      3. 对于下一个段，将开始设置为 3 μm，结束设置为 3 μm，并将时间设置为 20 秒。单击"Insert -->"。
      4. 对于最后一个段，将开始设置为 3 μm，将结束设置为 0 μm，将时间设置为 1 秒。然后单击 "Draw" 并关闭 Function Editor 窗口。
   2. 在主面板的 Force 选项卡上，勾选"indenter ramp after trigger"，并设置施加的力函数在达到 0.1 V.
   3. 的 Force 选项卡底部点击"Single Force"按钮，触发构建的施加的压痕函数，用于力松弛。
   4. 单力压痕完成后，抬起 AFM 头，使其与样品脱离接触，然后重新接合头并重新归零偏转。
   5. 重新定位载物台以找到新的感兴趣区域，并降低头部以进行接触。
   6. 重复两次测量，直到收集到所需的数据量。

Materials