激光消融-电感耦合等离子体质谱法可视化小鼠脑组织中的金属元素

摘要

来源：Hare, D. J., 等. 利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对脑组织中的金属进行成像。 J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了如何使用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对小鼠脑组织中的金属分布进行可视化和定量分析。该方案包括利用激光剥蚀产生样品颗粒的气溶胶，通过高温等离子体使颗粒离子化，再利用质谱技术根据离子的质荷比对其进行分离。随后使用专业软件生成定量图像，揭示金属在组织内的空间分布情况。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 分析前 LA-ICP-MS 的准备

1. 将标准样品和待测样品放入烧蚀室中，确保其位于激光烧蚀（LA）装置所配备的CCD相机的景深范围内。如果需要对仪器进行调谐，请加入合适的参考物质（例如，NIST 612 玻璃中的痕量元素）。用手拧紧烧蚀室门上的两个螺丝，以密封烧蚀室。
2. 在ICP-MS软件中，选择打开“维护”或类似面板中的氩气阀门，并在相应的对话框中将载气流速设置为1.2 L min^-1 。
   注意：本方案中使用氩气作为载气。某些示例中则使用氦气或氦气与氩气的混合气体作为载气。
3. 在LA软件中，点击“吹扫”按钮，用氩气至少吹扫烧蚀室30分钟。
   注意：可通过点击“吹扫时间”或类似按钮来调整吹扫时间。当使用具有双体积烧蚀池的烧蚀系统时，应周期性地将载物台移至各个角落，并对角线方向穿过整个烧蚀池，以尽可能去除烧蚀池中残留的空气。此操作可通过选择“归位载物台”或等效功能实现。
4. 点击“等离子体开启”以启动ICP-MS，并预热两小时，在此期间可执行步骤1.5至2.4。不同制造商的仪器设置可能有所不同。
5. 组织标准品的代表性烧蚀
   1. 选择线扫描工具，在组织表面绘制一条约3 mm长的单线烧蚀轨迹。
   2. 通过在实验列表中右键点击该烧蚀线并修改以下参数来设定参数：光束直径（由用户根据需要选择；此处使用30 µm的方形光束）、扫描速度（每秒4倍光束直径；即120 µm s^-1）和能量通量（软组织为0.3–0.5 J cm^-2；对于较硬基质，必要时可优化）。在30 µm的组织厚度下，激光束不会完全穿透组织全厚，从而避免来自显微镜支撑材料的潜在污染。可通过归一化至碳信号来校正烧蚀组织量的差异。通过选择“默认”单选按钮，将这些参数设为后续每条线的默认值。
   3. 选中初始线，右键点击并选择“复制扫描”，重复此操作共六次。确保每次复制的线在x-或y-轴方向上偏移一个光束直径的距离。这样每个标准品共获得七条线，线间距等于光束直径。
   4. 对每个标准品重复步骤1.5.1至1.5.3，确保每条线长度相同。
6. 在样品上绘制烧蚀区域时，请采用以下两种方法之一：
   注意：确保样品线使用与标准品相同的扫描参数（光束直径、扫描速度、能量通量）。
   1. 若LA系统配备宽视野成像功能，选择线工具，并从样品左上角开始绘制一条足够长的线，以覆盖样品最宽处，激光参数同1.5节所述。按照1.5.3节所述方式复制该扫描线，根据光束直径设定线间距，重复复制足够多次，以确保完全覆盖整个样品区域。
   2. 若无宽视野成像功能，则确定并记录覆盖整个样品的矩形四个角对应的x和y坐标（通常在主屏幕上显示为“载物台位置”或类似名称），并利用这些坐标布置平行的烧蚀线，以覆盖整个样品区域。
   3. 在样品扫描约20小时后，最迟应再次按照1.5节所述流程绘制标准品的间歇性扫描线。根据样品扫描持续时间，可能需要多次重复此操作。实验结束前，需额外进行一次标准品扫描。
      注意：在烧蚀池吹扫过程中确定x和y坐标时，若执行了归位操作及相关轴校准，先前获取的x和y坐标具体数值会发生变化，但其差值（即线长）保持不变。

2. 设置ICP-MS的数据采集方法

1. 对于标准样品的消融线，将线的长度除以激光扫描速度，以确定单条线的总分析时间。对样品线重复此计算。
2. 在ICP-MS软件中创建一个新方法（此处显示为“批处理”），并确保选择“时间分辨分析”或等效模式。选择需检测的质荷比（m/z）值，然后调整每个m/z的积分时间，使每个循环的总积分时间为0.25 s。点击“另存为批处理”并相应命名（例如，Std1）。
   注意：由于样品将以四倍于激光束直径的速度通过激光束，这可确保每个质量数记录的数据点相当于激光束直径的大小。例如，使用100 µm的光斑尺寸时，若扫描速度为400 µm s^-1，积分时间为0.25 s，则生成的图像将具有真实的像素尺寸。可通过调整积分时间以提高灵敏度；当积分时间增加至0.33 s时，扫描速度应减慢至三倍光束直径。
3. 对于标准样品，在相应输入框中输入每条线扫描的分析时间，并额外增加15 s，以计入激光预热和冲洗时间。输入样品运行列表（即 扫描执行的顺序），其采集次数（通常按顺序编号；即 001、002、等）应与标准线总数一致。
4. 对于样品，通过将当前方法或批处理另存为不同文件名来复制标准样品所用方法，并调整总采集时间（包括额外的15 s）和总采集次数，使其与将用于样品消融的线数相匹配。
   注意：由于大多数LA-ICP-MS系统采用单向触发（LA触发ICP-MS），必须确保在下一条消融线开始前，ICP-MS软件已处于等待LA触发的状态。此时ICP-MS的采集窗口将显示为“等待启动”。

3. 运行实验

1. 通过将第一个方法或批次添加到队列中来启动ICP-MS队列，并确保软件正在等待LA系统发出的触发信号。
2. 在LA软件中，单击“emission”启用激光电源，然后单击“run”，并在相应的输入框中将激光预热时间设置为10 s，冲洗时间设置为20 s。
   注意：该超前运行将确保当激光开始下一条烧蚀线时，ICP-MS已准备就绪，可立即开始采集新数据。
3. 单击“start”启动激光序列。若使用双体积腔室，请确保样品杯已就位。

4. 计算定量标准

注意： 将 ICP-MS 数据转换为图像的方法有多种，包括使用以开源语言编写自制软件工具、商业宏程序以及数据分析软件。此处使用的是基于专用 LA-ICP-MS 数据分析套件开发的最新软件插件。

1. 将包含运行数据（001.d、002.d、等等）的所有批次文件夹转移至一台已安装分析软件的独立计算机上。将每一批次各行的 *.csv 数据文件分别提取到单独的文件夹中。
   注意：强烈建议使用脚本自动将 *.csv 文件转移至新文件夹。详见附带的 Python 代码。该脚本适用于安捷伦 7700 或 8800 系列 ICP-MS，但可进行修改以适配其他厂商的输出文件格式。
2. 打开软件平台，按顺序依次点击选项卡，导入并分析标准样品，以生成定量图像，具体操作如下所述。
3. 要导入第一个标准批次的数据，请在“文件类型”中选择“Agilent .csv”，在“导入类型”中选择“整个文件夹”，并确认“日期格式”与计算机系统格式一致。点击“导入”，选择包含第一组标准样品 .csv 文件的文件夹，然后进入“基线”选项卡。
4. 基线扣除
   1. 使用工具栏主应用程序下拉菜单中的“自动选择”选项卡（命令 2），选择“来自导入的信息”，然后点击“继续”。
   2. 点击“全选”，并为积分选择“Baseline_1”。
   3. 为选取每次扫描线的前 10 秒（对应激光预热时间），通过输入起始秒数“0”和结束秒数“（扫描线持续时间 - 10 秒）”来裁剪数据，然后点击“添加积分”（例如，对于 35 秒的扫描线，输入“0”和“25”）。
5. 为选择样品数据，请按照 4.4 中所述使用“自动选择”选项卡，但积分选择“Output_1”。从每条标准线的起始和结束处裁剪数据，以排除背景信号（例如，对于 35 秒的扫描线，输入“13”和“4”）。
6. 为排除因标准样品中可能存在孔洞而导致的信号下降，在“样品”选项卡中，点击图表区域左上角的“通道”，选择一个信噪比较高的通道（例如，C13 或 P31）。记录信号中任何急剧下降的位置，并选择一个足够低（低于样品内正常信号波动水平）但又足够高（能够识别出信号急剧下降）的 CPS 值。
7. 点击“DRS”选项卡，并在“当前数据处理方案”中选择“Baseline_Subtract”。在“索引通道”中选择 4.6 中选定的通道，在“用于屏蔽低信号的阈值”中输入所选 CPS 值。在“屏蔽低信号前后裁剪的秒数”中输入一个 <0.5 s 的数值，以补偿激光信号传输至 ICP-MS 所造成的延迟。
8. 为确认低信号区域已被充分屏蔽，返回“样品”选项卡，选择一个已处理的通道轨迹（例如，Fe56_CPS）。如有必要，重复并优化 4.7 中的 CPS 值和“屏蔽低信号前后裁剪的秒数”。
9. 点击“结果”选项卡，从主应用程序下拉菜单中选择“导出数据”。输入文件名以生成结果的电子表格数据文件（例如，Std1 计算结果、Std2…）。
10. 在合适的电子表格程序中打开数据文件，计算每个待定量通道的 CPS 值。利用溶液雾化 ICP-MS 测得的预知金属浓度，计算每个可定量元素从 CPS 值转换为 ppm（µg g⁻¹）的转换因子。
11. 对本次运行中的所有标准样品组重复执行步骤 4.3 至 4.10。

5. 构建定量图像

1. 在命令提示符中输入“Biolite()”以启动软件。
2. 通过点击“Load Images”并选择包含样本图像 .csv 文件的文件夹来导入样本数据。
3. 背景校正
   1. 点击“Baselines”选项卡，对样本进行背景校正。在屏幕上显示的磷（P31）图像上，使用矩形绘制工具选择背景区域。尽可能多地选择多个区域，以生成全图像范围的信号/等离子体漂移图，从而充分补偿这些干扰因素。
   2. 为使背景信号更清晰可见，选择图像编辑工具（位于显示图像的左上角），然后右键单击图像。选择“Modify Image Appearance”，并将“First Color at Z=”更改为较大的负值（例如 -100,000）。完成后点击“Done”。
4. 点击“Standards”选项卡，打开 CPS/ppm 校正因子表格。将步骤 4.10 中各元素计算得到的数值填入对应位置。此步骤有助于校正 ICP-MS 的灵敏度漂移。点击“Go!”。
5. 从“Data”选项卡中打开“Data Browser”，其中保存了每种元素及每个处理步骤的图像。
6. 为导出最终图像，首先在“StdCorrImages”文件夹中选择目标图像，右键单击图像名称（*_ppm），然后点击“NewImage”。再次右键单击图像，选择“Modify Image Appearance”，以设定所需的调色板和颜色标度。通过右键单击图像并选择“Add Annotation”，在图像上添加颜色标度。从左上角的下拉菜单中选择“ColorScale”，并使用选项卡调整所需的颜色标度。
7. 导出图像时，确保已选中目标图像，转至“File”选项卡并点击“Save graphics…”。选择所需的格式并保存图像。或者，也可使用复制和粘贴工具传输所选图像。
8. 对所有感兴趣的图像重复执行步骤 5.6 和 5.7。
9. 定量分析离散区域
   1. 要启用 ROI 工具，请转至“Analysis”选项卡下的“Packages”，并选择“Image Processing”。
   2. 选择目标图像，转至“Image”选项卡并点击“ROI…”。点击“Start ROI draw”，使用绘图工具在样本中选择感兴趣区域。绘制完成后，点击“Finish ROI”。
   3. 为获取所选 ROI 的统计结果，请转至“Image”选项卡并点击“Stats…”。
   4. 将结果复制并粘贴至另一个电子表格中。对所有感兴趣的区域和元素重复执行 ROI 选择（5.9.2）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钠钙玻璃显微镜载玻片	n/a	n/a	普通载玻片适用于所有实验
NWR213 激光剥蚀系统	ESI Ltd	n/a	本实验中使用。其他厂商的产品也可适用，但可能需要对实验方案进行修改
Agilent 8800 系列 ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	本实验中使用。其他厂商的产品也可适用，但可能需要对实验方案进行修改
Iolite	Iolite Software	n/a	可从 http://iolite-software.com/ 获取。其他方法也可用，详见实验方案
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	可从 https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm 获取