利用大鼠模型进行二次谐波成像以研究微管蛋白缺陷

摘要

来源：Piazza, V., et al., 利用无标记非线性光学技术研究中枢髓鞘中微管蛋白依赖性缺陷。J. Vis. Exp. (2023)

本视频演示了使用双光子激发显微镜对大鼠脑组织切片中微管异常进行成像的操作流程。该方法利用二次谐波产生（SHG）信号来检测微管蛋白缺陷及髓鞘生成减少。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 转移至显微镜

1. 如果显微镜位于不同的房间，准备一个带有预热凝胶包的隔热箱，用于转移组织切片并维持其温度。该盒子还可使切片在成像前保持温暖。
2. 将样品置于显微镜下，并通过透射光直接经目镜观察，确保其在物镜下方位置正确。
   注意：目标是将预测的发射结构与激光的振荡方向对齐，以最大化发射（从而被检测到）的二次谐波产生（SHG）信号。
3. 去除多余的HBSS，使一层薄液膜覆盖整个样品。每隔几分钟目视检查液膜，避免过度蒸发和样品干燥。
   注意：在所述条件下，切片使用时间不超过20分钟。样品干燥会导致严重的假象效应（图1A）。如果需要更长的成像时间，建议定期将切片浸入温热的新鲜培养基中，而不是添加更多HBSS。当进行较长时间实验时，也建议使用灌流室以及胶水或低熔点琼脂糖来固定组织。
4. 为非扫描成像准备显微镜载物台，可能包括关闭暗培养室的所有门，或用黑色尼龙聚氨酯涂层织物覆盖培养室。

2. 成像

1. 选择透射路径中的“非解扫描”成像模式，以优化微弱的微管蛋白二次谐波（SH）信号的采集。
2. 选用LCI Plan-Neofluar 25倍/0.8数值孔径（NA）物镜。
3. 将激光功率设置在13 mW至26 mW之间，像素驻留时间为12.6 µs。采集图像尺寸不超过512像素 × 512像素，扫描速度设为5，信号累加次数为2，平均采集时间约为15秒。
   注意：使用更高的激光功率和/或更长的驻留时间可能会损伤样品（图1B）。
4. 首先使用485 nm短通滤光片（SP485）采集图像，随后第二步加入锐利的405 nm带通滤光片（BP405；图2）。
   注意：可通过同一探测器利用可见光激光线（405 nm或488 nm激光效果最佳）的残余激光光进行伪明场成像。

结果

图1：伪影示例。（A）由于样品干燥导致的伪影。（B）由于过度曝光导致的伪影。比例尺：30 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
405/10 nm BrightLine(R) 单通带滤光片	Semrock	FF01-405/10-25	直径 32 mm，带外壳环
黑色尼龙聚氨酯涂层织物	Thorlabs	BK5	5 英尺 × 9 英尺（1.5 m × 2.7 m）× 0.005 英寸（0.12 mm）厚
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM710NLO AxioObserver Z1	倒置显微镜，所用物镜为 LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA
Hanks′ 平衡盐溶液（HBSS）	Gibco	14025-076	可由粉末配制
NDD 模块，C 型	Zeiss	000000-1410-101	用于检测信号，减少光损失。内置 000000-1935-163 滤光片组及 SP485
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-031	可由粉末或片剂配制
脉冲激光器	Coherent	Chameleon Vision II	680–1080 nm 可调谐激光器