小鼠视网膜外植体中神经元树突动态的延时共聚焦成像

摘要

来源：Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. 利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群体进行神经元树突发育的延时成像。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用共聚焦显微镜观察活体小鼠视网膜外植体中树突动态变化的方法。视频概述了在共聚焦显微镜下稳定视网膜的步骤，进行落射荧光成像以观察星形细胞无长突中间神经元，并采集延时三维图像以监测无长突细胞树突形态的变化。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 活体全层视网膜标本的延时共聚焦成像

1. 组装用于直立共聚焦显微镜的活体成像培养室，如图1所示。
   注意：对于倒置共聚焦系统，将视网膜平铺样本以视网膜神经节细胞（RGC）面向下的方式直接放置于培养室的玻璃底盖玻片上。一旦视网膜与盖玻片接触，便不可再移动。
2. 向培养室中加入充氧的人工脑脊液（aCSF），并启动泵和温度控制器（温度设定为32–34 °C，流速1 mL/min）。温度不得超过34 °C。
3. 将视网膜平铺样本转移至灌流室时，先停止泵运行，并移除培养室中的aCSF。将带有视网膜平铺样本的混合纤维素酯（MCE）圆片放入（空的）培养室中。
4. 将样品压片置于平铺样本上；使用预湿润的压片以破坏表面张力。重新用预热的aCSF充满培养室，并以约1 mL/min的速度循环灌流aCSF。
5. 将装有25倍水浸物镜（数值孔径0.95）的物镜转盘置入成像室中。使用落射荧光照明筛选目标标记细胞（图1C）。
6. 调节成像体积以捕捉目标树突结构。
   注意：本研究以每帧1024 × 1024像素、z轴步长1 µm、每z层堆栈间隔2分钟的参数采集完整的树突结构。最终图像尺寸约为100 µm × 100 µm × 20 µm。
7. 为将激光功率调节至最佳设置，使用查找表识别过饱和和欠饱和像素。扫描过程中调节激光功率，确保无像素过饱和（即强度不达到255或以上）。根据需要持续成像，或直至荧光信号明显且可检测地下降并伴随噪声增加（通常为2–4小时）。
   注意：建议采用较低激光功率，因为去卷积算法在像素强度分布覆盖全动态范围时效果最佳。像素强度不应超过254；对神经突的实证分析表明，低于170的像素值更适用于去卷积。相较于单次较慢扫描，更推荐使用较快的扫描速度（400–600 Hz）并结合线平均（2–3次）。长时间成像区域常发生光漂白，但其他外植组织区域仍保持活性。可在平铺样本中对多个区域分别成像，每次2–4小时，总孵育时间可达6小时。超过6小时的成像尚未系统验证。神经突退化和出泡现象表明外植组织活性正在下降。

结果

图1：活细胞成像培养箱装置设置。 （A）活体成像用培养装置，显示加热、灌流溶液和成像组件。双加热系统包括一个带有加热功能的培养室平台（后部圆形结构，带有蓝色连接电极）和一个串联式溶液加热器。（B）1A的示意图。将视网膜平铺样本（红色）置于MCE膜（灰色）...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
混合纤维素酯膜（MCE）滤纸，亲水性，孔径 0.45 µm	Millipore	HABG01 300
聚乙烯一次性移液管	VWR	470225-034
腔室用聚乙烯管，PE-160 10英尺	Warner Instruments	64-0755
双通道加热控制器，型号 TC-344C	Warner Instruments	64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 浸入式物镜	Leica	15506374
加热控制器电缆	Warner Instruments	CC-28
大型浴槽孵育室，带切片支撑架	Warner Instruments	RC-27L
MPII 小型蠕动泵	Harvard Apparatus	70-2027
PM-6D 磁力加热平台（孵育室加热器）	Warner Instruments	PM-6D
MPII 小型蠕动泵用泵头管件	Harvard Apparatus	55-4148
样品锚定装置（Harps）	Warner Instruments	64-0260	样品锚定装置必须与孵育室兼容
Sloflo 在线溶液加热器	Warner Instruments	SF-28
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902
碳酰气（5% CO₂, 95% O₂）	AirGas	X02OX95C2003102	供应商可能因地区而异
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES，游离酸	Bio Basic	HB0264
盐酸溶液，1 N	Sigma-Aldrich	H9892
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich	M2670
pH 测试试纸（6.0–7.7）	VWR	BDH35317.604
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541
氯化钠（NaCl）	Bio Basic	DB0483
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	RDD007
ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	开源