轴切大鼠视网膜神经节细胞中轴突再生的成像与定量分析

摘要

来源： Portela-Lomba, M., et. al. 轴突切断的大鼠视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了与永生化人嗅鞘胶质细胞共培养的轴突切断大鼠视网膜神经节细胞（RGNs）中轴突再生的成像与定量分析。RGNs 经免疫标记后，胞体呈红色，轴突呈绿色。使用落射荧光显微镜采集图像，并通过图像分析软件定量计算具有轴突的神经元百分比及轴突再生指数。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 人嗅鞘神经胶质细胞（ihOEG，Ts12 和 Ts14）培养

注意：此操作需在组织培养生物安全柜内的无菌条件下进行。

1. 准备50 mL ME10 OEG培养基。
2. 在15 mL锥形管中准备5 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或DMEM/F12-胎牛血清（FBS）。
3. 将上述两种培养基在洁净的水浴中37 °C预热15分钟。
4. 在洁净的水浴中37 °C解冻Ts12和Ts14细胞冻存管。
5. 重悬细胞，并将其加入第2步中准备好的DMEM/F12-FBS培养基中。
6. 以200 × g离心5分钟。
7. 吸除上清液。
8. 加入500 µL ME10培养基，重悬细胞沉淀。
9. 在p60细胞培养皿中加入3 mL ME10培养基，并将细胞悬液逐滴加入。
10. 轻轻晃动培养皿，使细胞在皿内均匀分布。
11. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
    注意：细胞达到汇合后，至少还需传代一次以优化共培养状态。接种至盖玻片进行共培养前，需达到90%汇合度。汇合的p60培养皿中，Ts14细胞系平均细胞数量为7 × 10⁵，Ts12细胞系为2.5 × 10⁶。Ts12和Ts14细胞系应每2–3天传代一次。

2. 准备用于检测的 ihOEG（Ts12 和 Ts14）

注意：此步骤必须在视网膜神经节细胞（RGNs）解剖与共培养前24小时完成。

1. 用 10 µg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL）处理 12 mm Ø 盖玻片，处理 1 小时。
   注意： 盖玻片可在 PLL 溶液中放置过夜。
2. 用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片三次。
3. 从 p60 细胞培养皿中消化 Ts12 和 Ts14 ihOEG 细胞。
   1. 向 15 mL 圆底离心管中加入 4 mL DMEM/F12-FBS 培养基，并在洁净水浴中 37 °C 预热。
   2. 吸除培养皿中的培养基，并用 1 mL 1× PBS-乙二胺四乙酸（EDTA）洗涤细胞一次。
   3. 向 OEG 细胞中加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 3–5 分钟。
   4. 用 p1000 移液器收集细胞，并转移至步骤 3.1 中准备好的培养基中。
   5. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
   6. 吸除上清液。
   7. 加入 1 mL ME10 培养基，重悬细胞沉淀。
   8. 用血细胞计数板对细胞数量进行计数。
4. 在 24 孔板中，每孔加入 500 µL ME10 培养基，接种 80,000 个 Ts14 细胞或 100,000 个 Ts12 细胞至盖玻片上。
5. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 24 小时。

3. 视网膜组织解剖

注意：使用2月龄雄性Wistar大鼠作为RGN来源。每只大鼠（两个视网膜）用于24孔细胞培养板中的20个孔。使用前对手术器械进行高压灭菌。木瓜蛋白酶解离试剂盒为商业购买（材料表）。请按照供应商的说明进行试剂重悬。将D, L-2-氨基-5-磷酸戊酸（APV）重悬为5 mM储存液，并分装保存。

1. 在检测当天，配制以下培养基。
   1. 在 p60 细胞培养皿中加入 5 mL 冷的 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）（木瓜蛋白酶解离试剂盒中的 1 号小瓶）。
   2. 在 p60 细胞培养皿中加入复溶后的木瓜蛋白酶解离试剂盒 2 号小瓶（木瓜蛋白酶）以及 50 µL APV；然后加入 250 µL 复溶后的 3 号小瓶（DNase 加 5 µL APV）。
   3. 在无菌离心管中，将 2.7 mL 1 号小瓶溶液与 300 µL 4 号小瓶溶液（卵白蛋白-卵黏蛋白蛋白酶抑制剂）混合；再加入 150 µL 3 号小瓶溶液（DNase）和 30 µL APV。
   4. 配制 20 mL Neurobasal-B27 培养基（NB-B27）。
2. 用 CO₂ 窒息法处死一只大鼠。
3. 使用断头器切除大鼠头部，将其放入 100 mm 培养皿中，并用 70% 乙醇喷洒头部，然后置于超净工作台内。
4. 用剪刀剪除大鼠的胡须，以免干扰眼部操作。
5. 用镊子夹住视神经，将眼球拉出，以便用手术刀在眼球上做切口。
6. 取出晶状体和玻璃体，并将视网膜（呈橙色组织）拉出，其余眼组织层（包括色素上皮层）保留在眼内。
7. 将视网膜放入步骤 3.1.1 中准备好的 p60 细胞培养皿中。
8. 将视网膜转移至步骤 3.1.2 中准备好的 p60 细胞培养皿中，用手术刀将其切成大小约 < 1 mm 的小块。
9. 转移至 15 mL 塑料离心管中。
10. 将组织在 37 °C、5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育 30 分钟，每 10 分钟振荡一次。
11. 用玻璃巴斯德吸管反复吹打，使细胞团块解离。
12. 将细胞悬液在 200 x g 条件下离心 5 分钟。
13. 弃去上清液，为灭活木瓜蛋白酶，将细胞沉淀重悬于步骤 3.1.3 配制的溶液中（每 2 只眼使用 1.5 mL）。
14. 小心地将此细胞悬液用移液器转移至 5 mL 复溶后的 4 号小瓶溶液中。
15. 在 200 x g 条件下离心 5 分钟。
16. 在离心过程中，完全移除 OEG 24 孔细胞培养板（先前在步骤 2 中准备）中的 ME-10 培养基，并向每孔加入 500 µL NB-B27 培养基。
17. 弃去上清液，将细胞重悬于 2 mL NB-B27 培养基中。
18. 将 100 µL 视网膜细胞悬液接种至 m24 板的每一孔中，接种于 PLL 包被或 OEG 单层盖玻片上。
19. 在 NB-B27 培养基中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下维持培养 96 小时。

4. 免疫染色

1. 96 小时后，向培养基（600 µL）中加入等体积的含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS 溶液，固定细胞 10 分钟（PFA 最终浓度为 2%）。
2. 移除 24 孔板中的培养基和 PFA，再次加入 500 µL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× PBS 溶液，室温孵育 10 分钟。
3. 弃去固定液，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
4. 用含 0.1% Triton X-100 和 1% FBS 的 PBS 缓冲液（PBS-TS）封闭 30–40 分钟。
5. 在 PBS-TS 缓冲液中配制一抗：SMI31 单克隆抗体（针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白），稀释比例为 1:500；514 兔多克隆抗血清（识别 MAP2A 和 B 蛋白），稀释比例为 1:400。
6. 将一抗加入共培养样本中，4 °C 条件下孵育过夜。
7. 次日，弃去一抗，用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
8. 在 PBS-TS 缓冲液中配制二抗：针对 SMI-31 使用抗小鼠 Alexa Fluor 488（1:500）；针对 514 使用抗兔 Alexa-594（1:500）。
9. 在室温（RT）避光条件下，用相应的荧光标记二抗孵育细胞 1 小时。
10. 在避光条件下，用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，每次 5 分钟。
11. 最后，用封片剂（材料表）封片，并于 4 °C 保存。
    注意： 如有需要，可进行 DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）荧光核染色。封片前，在避光条件下用含 DAPI（10 µg/mL 的 1× PBS 溶液）孵育细胞 10 分钟，随后用 1× PBS 洗涤盖玻片 3 次，最后用封片剂封片。

5. 轴突再生定量分析

注意：样品需在落射荧光显微镜的40倍物镜下进行定量。每种处理组应随机选取至少30个视野拍摄图像，且每个处理组至少包含200个神经元用于定量分析。每个实验至少重复三次。

1. 通过 SMI31 阳性神经突确定具有轴突的神经元所占百分比，相对于总 RGN 群体（使用 MAP2A/B 514 阳性免疫染色标记神经元胞体和树突进行鉴定）。
2. 量化轴突再生指数或平均轴突长度（µm/神经元）。该参数定义为所有已识别轴突长度（单位：µm）的总和除以计数的神经元总数（无论其是否具有轴突）。轴突长度的测定采用图像软件 ImageJ（NIH-USA）中的 NeuronJ 插件完成。
3. 使用适当的软件计算均值、标准差及统计学显著性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体 514	参考文献 34		兔多克隆抗血清，可识别 MAP2A 和 B。
抗体 SMI-31	BioLegend	801601	针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白的单克隆抗体
Anti-mouse Alexa Fluor 488 抗体	ThermoFisher	A-21202
Anti-rabbit Alexa Fluor 594 抗体	ThermoFisher	A-21207
B-27 补充剂	Gibco	17504044
D,L-2-氨基-5-磷酰戊酸	Sigma	283967	NMDA 受体抑制剂
DAPI	Sigma	D9542	细胞核荧光染料
DMEM-F12	Gibco	11320033	细胞培养基
FBS	Gibco	11573397	胎牛血清
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	胎牛血清
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	封片介质
ImageJ	美国国立卫生研究院 (NIH-USA)		图像分析软件
L-谷氨酰胺	Lonza	BE17-605F
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	神经元细胞培养基
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington 生物化学公司	LK003150	用于神经细胞分离
PBS	自制
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
青霉素/链霉素/两性霉素 B	Lonza	17-745E	抑菌和杀菌剂
垂体提取物	Gibco	13028014	牛垂体提取物
聚-L-赖氨酸 (PLL)	Sigma	A-003-M