轴切大鼠视网膜神经节细胞中轴突再生的成像与定量分析

摘要

来源： Portela-Lomba, M., et. al. 轴突切断的大鼠视网膜神经节神经元与嗅鞘胶质细胞的共培养，作为成年神经元轴突再生的体外模型。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了与永生化人嗅鞘胶质细胞共培养的轴突切断大鼠视网膜神经节细胞（RGNs）中轴突再生的成像与定量分析。RGNs 经免疫标记后，胞体呈红色，轴突呈绿色。使用落射荧光显微镜采集图像，并通过图像分析软件定量计算具有轴突的神经元百分比及轴突再生指数。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会的审核与批准。

1. 人嗅鞘神经胶质细胞（ihOEG，Ts12 和 Ts14）培养

注意：此操作需在组织培养生物安全柜内的无菌条件下进行。

1. 准备50 mL ME10 OEG培养基。
2. 在15 mL锥形管中准备5 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）或DMEM/F12-胎牛血清（FBS）。
3. 将上述两种培养基在洁净的水浴中37 °C预热15分钟。
4. 在洁净的水浴中37 °C解冻Ts12和Ts14细胞冻存管。
5. 重悬细胞，并将其加入第2步中准备好的DMEM/F12-FBS培养基中。
6. 以200 × g离心5分钟。
7. 吸除上清液。
8. 加入500 µL ME10培养基，重悬细胞沉淀。
9. 在p60细胞培养皿中加入3 mL ME10培养基，并将细胞悬液逐滴加入。
10. 轻轻晃动培养皿，使细胞在皿内均匀分布。
11. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。
    注意：细胞达到汇合后，至少还需传代一次以优化共培养状态。接种至盖玻片进行共培养前，需达到90%汇合度。汇合的p60培养皿中，Ts14细胞系平均细胞数量为7 × 10⁵，Ts12细胞系....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体 514	参考文献 34		兔多克隆抗血清，可识别 MAP2A 和 B。
抗体 SMI-31	BioLegend	801601	针对 MAP1B 和 NF-H 蛋白的单克隆抗体
Anti-mouse Alexa Fluor 488 抗体	ThermoFisher	A-21202
Anti-rabbit Alexa Fluor 594 抗体	ThermoFisher	A-21207
B-27 补充剂	Gibco	17504044
D,L-2-氨基-5-磷酰戊酸	Sigma	283967	NMDA 受体抑制剂
DAPI	Sigma	D9542	细胞核荧光染料
DMEM-F12	Gibco	11320033	细胞培养基
FBS	Gibco	11573397	胎牛血清
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	胎牛血清
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	封片介质
ImageJ	美国国立卫生研究院 (NIH-USA)		图像分析软件
L-谷氨酰胺	Lonza	BE17-605F
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	神经元细胞培养基
木瓜蛋白酶解离系统	Worthington 生物化学公司	LK003150	用于神经细胞分离
PBS	自制
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
青霉素/链霉素/两性霉素 B	Lonza	17-745E	抑菌和杀菌剂
垂体提取物	Gibco	13028014	牛垂体提取物
聚-L-赖氨酸 (PLL)	Sigma	A-003-M