使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

Abstract

来源： Daniele， F.， et.al TIRFM 和 pH 敏感的 GFP 探针评估 SH-SY5Y 神经母细胞瘤细胞中的神经递质囊泡动力学：细胞成像和数据分析。J. Vis. Exp.(2015).

本视频演示了使用全内反射荧光 （TIRF） 显微镜对人神经母细胞瘤细胞进行成像，以观察荧光团标记的突触囊泡。细胞首先以落射荧光模式聚焦。然后进行调整以实现全内反射，产生选择性激发膜附近荧光团的消逝波。在 TIRF 成像之前，需要配置采集参数并设置采样频率。

Protocol

1. 细胞培养和转染

1. SH-SY5Y 细胞培养
   注：实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y （ATCC# CRL-2266） 进行。SH-SY5Y 细胞以漂浮簇和贴壁细胞的混合物形式生长。按照方案中报告的说明（细胞密度、分流率等），使生长的细胞牢固地附着在玻璃盖上，这对于全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 至关重要。<>
2. 开始之前，在层流生物安全柜下，制作适当体积的无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液和培养基。
   1. 制备 50 ml 浓度为 150 mM 氯化钠 （NaCl）、24 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的 PBS。筛选解决方案。
   2. 用 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 制备 50 ml 细胞培养基，其中含有高葡萄糖、10% 热灭活胎牛血清 （FBS）、青霉素 （100 U/ml）、链霉素 （100 μg/ml）、L-谷氨酰胺 （2 mM） 和丙酮酸钠 （1 mM）。筛选解决方案。
3. 取出完全生长培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
4. 将细胞与 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 （EDTA）（用于 6 cm 培养皿）在 37 °C、5% CO₂ 下孵育 5 分钟，并使用移液器分离细胞。
5. 通过加入 2 ml DMEM 灭活胰蛋白酶，并通过以 3....

Results

图 1.TIRF 显微镜设置。TIRF 显微镜系统的示意图和图像（插图）。该装置包括 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜 （A）、多线 100 mW 氩离子激光器 （B） 和 TIRF 滑块 （C）。显示激光（绿线）和白光（黄线）。使用 100 × 油浸物镜对细胞进行成像。数字图像在制冷型 RetigaSRV Fast CCD 相机上捕获。图中显示了反射器模块、发射 （488/10 nm） 和激发（波段通过 525/50 nm）滤光片、准直器 （L1） 和聚焦 （.......

Materials