使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

本文内容

摘要

来源：Daniele, F., 等利用全内反射荧光显微镜和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动力学：细胞成像与数据分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对人神经母细胞瘤细胞进行成像，以观察荧光标记的突触小泡。首先在落射荧光模式下对细胞进行聚焦，随后调整参数以实现全内反射，产生倏逝波，选择性激发靠近细胞膜的荧光分子。在进行TIRF成像前，需配置采集参数并设定采样频率。

方案

1. 细胞培养与转染

SH-SY5Y 细胞培养
注意： 本实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞（ATCC# CRL-2266）。SH-SY5Y 细胞以悬浮细胞团和贴壁细胞的混合形式生长。请遵循本方案中所述的操作说明（如细胞密度、传代比例等），以获得牢固贴附于玻璃盖玻片的细胞，这对于全内反射荧光显微镜（TIRFM）至关重要。
1. 开始前，在超净台内配制适量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基。
  1. 配制 50 ml PBS 溶液，含 150 mM 氯化钠（NaCl）、24 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4。过滤溶液。
  2. 配制 50 ml 细胞培养基：含高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 热灭活胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）、L-谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM）。过滤溶液。
2. 弃去完全培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
3. 加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（适用于 6 cm 培养皿），在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟，用移液器吹打使细胞脱落。
4. 加入 2 ml DMEM 终止胰蛋白酶消化....

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结果

图1. TIRF显微镜装置。TIRF显微镜系统的示意图及图像（插图）。 该装置包括Axio Observer Z1电动倒置显微镜（A）、多谱线100 mW氩离子激光器（B）和TIRF滑块（C）。图中显示了激光（绿线）和白光（黄线）。使用100 ×油浸物镜对细胞进行成像。数字图像由冷却的RetigaSRV Fast CCD相机采.......

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本文使用的材料清单

姓名

公司

目录编号

仪器设备

Axio Observer Z1

Zeiss

491912-9850-000

倒置显微镜http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction

多线氩离子激光器 Lasos 77

拉索斯