使用全内反射荧光显微镜进行细胞成像

摘要

来源：Daniele, F., 等 利用全内反射荧光显微镜和pH敏感型GFP探针评估SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中神经递质囊泡动力学：细胞成像与数据分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了利用全内反射荧光（TIRF）显微镜对人神经母细胞瘤细胞进行成像，以观察荧光标记的突触小泡。首先在落射荧光模式下对细胞进行聚焦，随后调整参数以实现全内反射，产生倏逝波，选择性激发靠近细胞膜的荧光分子。在进行TIRF成像前，需配置采集参数并设定采样频率。

方案

1. 细胞培养与转染

1. SH-SY5Y 细胞培养
   注意： 本实验使用人神经母细胞瘤 SH-SY5Y 细胞（ATCC# CRL-2266）。SH-SY5Y 细胞以悬浮细胞团和贴壁细胞的混合形式生长。请遵循本方案中所述的操作说明（如细胞密度、传代比例等），以获得牢固贴附于玻璃盖玻片的细胞，这对于全内反射荧光显微镜（TIRFM）至关重要。
   1. 开始前，在超净台内配制适量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）和培养基。
      1. 配制 50 ml PBS 溶液，含 150 mM 氯化钠（NaCl）、24 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.4。过滤溶液。
      2. 配制 50 ml 细胞培养基：含高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 热灭活胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 µg/ml）、L-谷氨酰胺（2 mM）和丙酮酸钠（1 mM）。过滤溶液。
   2. 弃去完全培养基，用 3 ml PBS 洗涤细胞。
   3. 加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（适用于 6 cm 培养皿），在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟，用移液器吹打使细胞脱落。
   4. 加入 2 ml DMEM 终止胰蛋白酶消化作用，300 x g 离心 5 分钟收集细胞。
   5. 弃去上清液，向细胞沉淀中加入 1 ml DMEM，反复吹打至细胞充分分散为单细胞悬液。
   6. 按 1:4 比例传代至新的含 3 ml 完全培养基的 6 cm 培养皿中。将细胞置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。每周传代一次，或当细胞覆盖培养皿表面面积达 80–90% 时进行传代。
2. 用于成像的 SH-SY5Y 细胞接种
   1. 进行 TIRFM 实验时，需将细胞接种于玻璃盖玻片上。使用厚度为 0.17 ± 0.005 mm、折射率为 1.5255 ± 0.00015 的玻璃盖玻片。开始前，按以下步骤处理盖玻片：
      1. 用 90% 乙醇浸泡玻璃盖玻片过夜（O/N）。
      2. 用蒸馏水彻底冲洗（更换蒸馏水三次），并在干燥烘箱中干燥。
      3. 将盖玻片放入玻璃培养皿中，于预热至 200 °C 的烘箱中灭菌 3 小时。
   2. 转染前一天，将每片盖玻片放入 3.5 cm 培养皿中，加入 1 ml 培养基，在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。
   3. 按照步骤 1.1.3–1.1.5 所述方法进行胰酶消化，将细胞沉淀重悬于 1 ml 完全培养基中并计数。计算每孔加入细胞悬液的合适体积，使每孔细胞数量为 3 × 10⁵ 个。该密度对于细胞最佳生长和高效转染至关重要。在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜（O/N）。
3. 使用聚乙烯亚胺（PEI）对 SH-SY5Y 细胞进行转染
   注意： 为观察突触小泡动态，本实验使用含有 synapto-pHluorin 的 pCB6 载体。synapto-pHluorin 是通过将一种 pH 敏感型绿色荧光蛋白（GFP）变体与囊泡膜蛋白 synaptobrevin 2 进行同框融合而构建的。该载体已被广泛用于研究神经元中突触小泡的特性。
   1. 开始转染前，配制以下溶液各 10 ml。溶液最多可保存 1 个月。
      1. 配制 150 mM NaCl 溶液，用 0.01 N 盐酸（HCl）调节 pH 至 5.5。
      2. 在 150 mM NaCl 溶液中配制 10% 聚乙烯亚胺（PEI；25 kDa 线性）溶液。溶液 pH 升至 8.8，用 0.01 N HCl 调节 pH 至 7.8。
   2. 接种细胞 24 小时后，弃去原培养基，更换为 1.5 ml 完全培养基。将细胞继续置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。
   3. 在超净台内，于 1.5 ml 微量离心管中，每 3.5 cm 培养皿加入 3 µg 质粒 DNA、25 μl 150 mM NaCl 溶液和 100 μl PEI 溶液。
   4. 涡旋 10 秒，室温（RT）孵育 DNA/PEI 混合物 30 分钟。
   5. 将 DNA/PEI 混合物小心加入含细胞和盖玻片的培养皿中，轻轻摇晃使试剂均匀分布。
   6. 4 小时后更换培养基，继续在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育过夜（O/N）。转染后 24–48 小时进行成像实验。

2. 通过TIRFM进行细胞成像

1. 成像设置
   1. 使用图1中描述的装置进行全内反射荧光（TIRF）成像。该装置包括一台电动倒置显微镜（图1，插图A）、激光光源（图1，插图B）和TIRF滑块（图1，插图C）。通过高数值孔径（NA 1.45 Alpha Plan-Fluar）100倍油浸物镜实现TIRFM照明。
   2. 对于TIRFM照明，采用多谱线（458/488/514 nm）100 mW氩离子激光器。使用单模光纤将线偏振激光通过TIRF滑块引入光路。将TIRF滑块插入反射光路的视场光阑平面。
      1. 对于宽场照明，将显微镜连接至常规汞短弧灯HBO白光源。滑块中的保偏双棱镜可实现TIRF照明与白光的同时组合。
   3. 使用安装在滤光轮上的激发滤光片（带宽488/10 nm）对激光进行滤光，并将其引入激光光路。采用高速、软件控制的快门，以实现对激光照明的快速调控。对于pHluorin分析，安装带通发射滤光片（525/50 nm）。使用Image ProPlus软件在冷却的快速CCD相机上采集数字图像（512 × 512像素）。
2. 实现TIRF照明（图2）
   1. 开启激光器、计算机、相机、滤光轮和快门控制器；实验开始前等待20分钟，以便激光器预热并稳定。
   2. 成像前，配制适量以下溶液。
      1. 配制50 ml Krebs（KRH）溶液：125 mM NaCl、5 mM氯化钾（KCl）、1.2 mM硫酸镁（MgSO₄）、1.2 mM磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、25 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（调至pH 7.4）、2 mM氯化钙（CaCl₂）和6 mM葡萄糖。
      2. 配制10 ml KCl-KRH溶液（pH 7.4）：80 mM NaCl、50 mM KCl、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、25 mM HEPES（调至pH 7.4）、2 mM CaCl₂和6 mM葡萄糖。
   3. 取下带有转染细胞的玻璃盖玻片，并将其插入适当的成像室中。组装成像室，并在玻璃中央加入500 µl KRH溶液。
   4. 在物镜上滴加浸油。将成像室放置于显微镜载物台上，使物镜位于盖玻片下方。在样品上方放置安全防护罩。
   5. 在落射荧光模式下，对焦至盖玻片（上表面），并选择位于成像室中心的转染细胞。选择那些在曝光时间低于80毫秒时即可清晰记录荧光信号的细胞。
   6. 在软件控制下，切换至实时TIRF照明模式。
   7. 为设定TIRF配置，请检查从物镜射出并在样品盖上形成的光束位置（图2B）。当光束位于物镜中心时（图2A，左），TIRF样品盖中心可见一个光斑（图2B，左），此时细胞处于落射荧光成像模式（多个焦平面，背景荧光较强；图2C，左）。
   8. 为达到临界角，使用TIRF滑块上的角度调节螺丝（图1C）沿Y方向（前后）移动聚焦光斑（图2B，中）。当光束以大于临界角的角度汇聚于样品平面时（图2A，右），光斑消失，在样品盖中央出现一条清晰、细直的聚焦线（图2B，右）。
   9. 使用细胞样品精细调节TIRF角度（图2C）。在视频中观察荧光图像。此阶段仍可见类似落射荧光的图像。轻轻旋转调节螺丝，直至达到TIRF条件：仅细胞的一个光学层面处于焦点（即与盖玻片接触的质膜）。此时获得高对比度的平面图像（图2C，右）。
3. 样品成像
   1. 设置单通道时间序列实验。为最小化光漂白，采用低曝光时间与高增益进行图像采集。合适的曝光时间为40–80毫秒。以1–2 Hz的采样频率采集图像。囊泡动力学可在更高频率（10 Hz）下更清晰地观察。常规观察时间通常为2分钟。

结果

图1. TIRF显微镜装置。TIRF显微镜系统的示意图及图像（插图）。 该装置包括Axio Observer Z1电动倒置显微镜（A）、多谱线100 mW氩离子激光器（B）和TIRF滑块（C）。图中显示了激光（绿线）和白光（黄线）。使用100 ×油浸物镜对细胞进行成像。数字图像由冷却的RetigaSRV Fast CCD相机采...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器设备
Axio Observer Z1	Zeiss	491912-9850-000	倒置显微镜http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/products/light-microscopes/axio-observer-for-biology.html#introduction
多线氩离子激光器 Lasos 77	拉索斯	00000-1312-752	多线（458/488/514 nm），100 mW 氩离子激光器 http://www.lasos.com/products/argon-ion-laser
激光TIRF调节滑块	蔡司	423681-9901-000	http://www.zeiss.com/microscopy/zh_cn/products/imaging-systems/single-molecular-imaging-laser-tirf-3.html
100倍物镜	Zeiss	421190-9900-000	油，NA 1.45 Alpha-Planhttps://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=o&a=v&&m=a&id=421190-9900-000&ss=1
CCD相机 RetigaSRV Fast 1394	QImaging		http://www.qimaging.com/products/datasheets/Retiga-SRV.pdf
LAMBDA 10-3 智能快门光学滤光轮转换器	Sutter Instrument Company		http://www.sutter.com/IMAGING/lambda103.html
软件
Image ProPlus 6.3 软件	Media Cybernetics		斑点选择，感兴趣区域选择，荧光强度测定http://www.mediacy.com/index.aspx?page=IPP
Excel	微软		光漂白校正，全细胞与单囊泡分析http://office.microsoft.com/it-it/excel/
GraphPad Prism 4.00	GraphPad Software, Inc.		统计分析http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/