用于表视胞吐事件的全内反射荧光显微镜

Abstract

资料来源：Winkle， CC 等人。利用组合方法来定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生过程中的作用。J. Vis. Exp. （2016年）

该视频演示了全内反射荧光 （TIRF） 显微镜，用于可视化皮质神经元中的胞外活动。pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）标记物在囊泡融合时发出荧光，选择性TIRF激发在延时成像中捕获膜近端胞吐作用。

Protocol

1. 通过全内反射荧光 （TIRF） 显微镜对胞外活动进行成像

注意

：该协议需要专门的显微镜设备，包括用于保持温度、湿度和二氧化碳 （CO₂） 的环境室、配备落射荧光照明的倒置全内反射荧光 （TIRF） 显微镜、高放大倍率/高数值孔径 （NA） TIRF 物镜、自动 XYZ级和灵敏的电荷耦合器件 （CCD） 检测器。该协议使用配备100x 1.49 NA TIRF物镜、固态491 nm激光器和电子倍增CCD（EM-CCD）的全自动倒置显微镜。所有设备均由成像和激光控制软件控制。在开始成像协议之前，打开环境室、载物台、灯、计算机和相机的电源。

1. 在成像软件中选择物镜。物镜就位后，将物镜加热器固定在项圈周围。
在将
2. 载物台培养箱固定在载物台槽中之前，确认物镜已完全降低。将蒸馏水均匀倒入舞台培养箱入口中，以防止溢出。
打开
3. 培养系统。打开 CO₂ 罐的阀门，并根据制造商的说明确认压力适合系统。让腔室有一段时间达到 5% CO₂ 和 37 °C。在添加成像皿之前，将一个空盘放入培养箱中，以避免物镜上出现水凝结。
4. 打开激光源电源。
5. 打开舞台培养箱，向镜头中加入浸油。将样品放入培养箱中，并用稳定臂或培养皿重物稳定。抬起物镜，直到油与样品底部接触。切换到透射光照明并通过目镜找到神经元焦平面。
6. 启动激光软件并将其连接到激光控制软件。将照明设置为宽场并选择物镜（建议使用 100x 1.49 NA TIRF）。设置样品的折射率（细胞 ~1.38）。通过取消选中 491 nm 激光器的"TTL"（晶体管-晶体管逻辑）来调整激光强度。将滑块调整为 100，然后将其调回 20% 到 40% 之间的值。重新检查"TTL"。
在
7. 透射光照明下再次聚焦样品。进入成像软件，选择491nm激光照明，打开快门。微调天花板上激光的焦点，并在取下聚光镜的情况下将其居中到闭场光阑的中心。将聚光镜倒置在光学台上，以免划伤镜头。
8. 更换聚光镜，转到 TIRF 软件，并将穿透深度 （PD） 设置为 110 nm。然后，从宽场照明切换到 TIRF 照明模式进行成像。
使用
9. 落射荧光源的宽场落射荧光通过眼睛找到囊泡相关膜蛋白 2 （VAMP2）-叶绿素表达细胞。
   1. 调整成像参数（曝光时间、增益和激光功率），以使用最短的曝光时间和激光强度来最大化信噪比和动态范围，以减少光漂白和光毒性（例如，曝光在 50 - 100 毫秒之间，在 30% 最大激光功率下增益为 15 - 30
   ）。
   2. 设置每个单元格的连续自动对焦。采集延时图像集，每 0.5 秒采集一次，持续 5 分钟。对于 netrin-1 刺激条件，将 500 ng/ml netrin-1 添加到层流罩中的细胞培养皿中，并在成像前将培养皿放回培养箱 1 小时。

Materials