鸡胚中神经与血管网络的可视化

摘要

来源：Delalande, J.，等．利用鸡胚胎^GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双标记．J. Vis. Exp. （2015）

本视频展示了将一只发育阶段相匹配的转基因鸡胚中表达GFP标记的供体神经管移植到受体鸡胚体节1至7水平区域，随后使用亲脂性荧光染料进行血管标记。该联合方法可在体视荧光显微镜下直接观察胚胎，从而实现对神经移植物整合及血管网络在卵内（in ovo）发育过程的研究。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 犯病审查委员会的审核。

1. 移植组织

1. 使用玻璃微量移液器，将解剖好的神经管从表面皿小心转移至宿主胚胎中。将神经管置于正确的头尾方向，并用显微手术刀将其轻轻推至鸡宿主切除区域的邻近位置。保留一小段外胚层附着于神经管背侧，或在背侧表面剪一小切口，以标识神经管的方向。
   1. 如有必要，使用显微手术刀将外植体修剪至与切除区域完全相同的大小。
2. 轻柔地将神经管引导至去除此组织的区域，并使其背侧朝向正确位置。使用连接在吹管上的玻璃微量移液器吸除移植物周围的PBS和/或液体，以促进供体与宿主组织的黏附，帮助移植物稳定植入。
3. 用24 mm宽的透明胶带完全封闭窗口，防止脱水和污染。
4. 用铅笔在蛋壳上标记嵌合胚胎的编号，并在实验记录本中记录其编号。将鸡蛋放回培养箱中继续发育。

2. 将DiI注入宿主胚胎的血管中

1. 在预定的实验时间点（此处为3至10天后），从培养箱中取出嵌合胚胎，使用直头剪刀移除透明胶带，以暴露蛋内的胚胎。
2. 如有必要，可用剪刀扩大蛋壳上的窗口。注意避免损伤附着在蛋壳上的尿囊绒毛膜，否则会导致出血，影响血管标记效果。
3. 在卵黄囊上选择一条易于接近的静脉，确保血流方向朝向胚胎。选择卵黄静脉的分支点之一（图1B、C）。
   注意：在胚胎发育第6.5至7.5天（E6.5–E7.5），可能需要用镊子轻轻拨开附着在卵黄静脉上方的尿囊绒毛膜以暴露血管。而在E8.5之后，由于尿囊绒毛膜已完全覆盖胚胎，只能选择其上的静脉进行注射。
4. 使用两把Dumont #5镊子朝相反方向撕开选定注射位点上方的卵黄膜。
5. 使用Dumont #5镊子折断一根拉制的玻璃针，并在装入CellTracker CM-DiI前将其尖端直径调整至与目标静脉大致相当。将DiI储存液配制成40 µg/µl的DMSO溶液，于-20 °C保存。工作液用0.3 M蔗糖/PBS配制，浓度为4 µg/µl。
   1. 用口吸管将5–10 µl的DiI工作液吸入玻璃针中。较晚期的胚胎可能需要25 µl或更多。自E8.5起，胚胎的静脉更大且肌层更发达，注射前可能需要用Dumont #5镊子固定血管，再用装载DiI的玻璃针刺入。
6. 迅速将玻璃针插入静脉，通过口吸管平稳吹入，使DiI缓慢进入血流，避免形成血栓。也可选用压力注射仪进行DiI递送。

结果

图1. DiI静脉注射。（A）推荐使用的器械：a）Parafilm上滴加的CellTracker CM-DiI，b）拉制的玻璃注射针，c）口吸管。（B）对E4期嵌合体鸡胚进行静脉内DiI注射的示意图。（C）in ovo DiI静脉注射过程，显示含DiI的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
受精的鸡卵	Henry Stewart 和 Co，Louth，英国
受精的 GFP 鸡蛋	爱丁堡大学罗斯林研究所转基因鸡设施
蛋孵育器（Profi-H Hatcher）	美国加利福尼亚州莱昂技术公司	910-033
14C 培养箱	精密冷却培养箱，Leec Ltd.，诺丁汉，英国	模型 LT2
体视显微镜	LEICA	Model MZ 12.5
数码相机	LEICA	DC500
图像采集软件	LEICA	IM50
鹅颈式卤素冷光源	Advanced Imaging Concepts, Inc	KL 1500 LCD
口管	SIGMA - ALDRICH	A5177
移液管，聚乙烯	SIGMA - ALDRICH	Z350796
Dumont #5 镊子	精细科学工具	11251-30
微型钉	Fine Science Tools	26002-15
Dumont AA 镊子，Inox 环氧树脂涂层	Fine Science Tools	11210-10
透明胶带（透明，24 mm 宽）	任何供应商
CellTracker CM-DiI	分子探针	C-7001
硼硅酸盐玻璃毛细管，薄壁无纤维	哈佛仪器	PY8 30-0035