小鼠皮质神经元轴突分支的实时体外成像

摘要

资料来源：Winkle， CC 等人。 利用组合方法来定义质膜递送在轴突分支和神经元形态发生过程中的作用。J. Vis. Exp.（2016年）

该视频演示了一种使用差分干涉对比 （DIC） 显微镜观察皮质神经元中实时轴突分支的实时成像技术。延时视频捕捉了 netrin-1 处理的效果，netrin-1 是一种信号分子，可诱导轴突中的局部胞吐作用和细胞骨架重排。这些过程启动膜突起，发育成成熟的轴突分支，为神经元发育提供了见解。

方案

1. 轴突分支的微分干涉对比度 （DIC） 延时显微镜

注意：虽然该协议使用 DIC，但其他透射光显微镜方法可用于相同的目的（例如：相差）。

在

1. 体外 （DIV） 2 天时，将含有未转染神经元的玻璃底成像皿放入预热的环境室中，以保持 5% CO2 和 37 °C 的潮湿环境。使用配备 60 倍平面复消色差、1.4 数值孔径 （NA） DIC 物镜和高 NA 聚光镜的显微镜，以获得最佳图像质量和分辨率。
2. 调整焦平面，使用透射光照明通过眼镜找到神经元。
3. 使用成像软件上的多区域采集功能，查找并保存至少 6 个细胞的 XYZ 位置。放置载物台，使感兴趣的神经元适合视野内，以获得最佳结果。
   1. 用 250 ng/ml netrin-1 刺激，然后按"开始多区域采集"。每 20 秒在每个位置按顺序采集图像，持续 24 小时，暂停采集并根据需要重新聚焦。
4. 使用 Apps>Review Multi Dimensional Data>open 文件名查看成像软件中的图像。识别在成像过程中形成的稳定轴突分支（20μm长）。使用绘制线工具测量从轴突底部到尖端的稳定轴突分支，以确保满足 20 μm 长度的资格。
   1. 在电子表格中，记录膜突起在后来形成分支的区域开始时的 netrin 刺激后的帧数，以及当新生分支长度达到 20 μm 时的 netrin 刺激后的帧数。
   将
   2. 突起和分支形成之间的帧数乘以 20 秒，以计算每个分支的形成时间。

材料