小鼠皮层神经元轴突分支的实时体外成像

摘要

来源：Winkle, C. C., et al. 利用联合方法定义质膜递送在轴突分支与神经元形态发生中的作用。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用微分干涉差（DIC）显微镜进行活体成像的技术，用于实时观察皮层神经元中的轴突分支过程。延时视频记录了净素-1（netrin-1）处理对轴突的影响，netrin-1是一种信号分子，可诱导轴突内局部胞吐作用及细胞骨架重排。这些过程引发细胞膜突起，并进一步发育为成熟的轴突分支，从而为神经元发育机制提供深入见解。

方案

1. 轴突分支的微分干涉差时差显微镜观察

注意：尽管本方案使用了微分干涉差（DIC）显微技术，其他透射光显微方法也可用于相同目的（例如：相差显微技术）。

1. 2天时 体外 （DIV），将含有未转染神经元的玻璃底成像培养皿置于预热的环境培养箱中，以维持37 °C、5% CO₂的湿润环境。使用配备60倍平场复消色差、数值孔径（NA）1.4的微分干涉差（DIC）物镜和高NA聚光镜的显微镜，以获得最佳图像质量和分辨率。
2. 调节焦平面，通过透射光照明并在目镜下观察以找到神经元。
3. 使用成像软件的多区域采集功能，找到并保存至少6个细胞的XYZ位置。调整载物台位置，使目标神经元位于视野范围内，以获得最佳效果。
   1. 用 250 ng/ml 的 netrin-1 刺激，并点击“开始多区域采集”。每 20 秒在每个位置依次采集图像，持续 24 小时，根据需要暂停采集并重新对焦。
4. 使用应用程序在成像软件中查看图像>多维数据综述>打开文件名称。识别成像期间形成的稳定轴突分支（长度为20 µm）。使用线条绘制工具，从轴突基部至末端测量一条稳定的轴突分支，以确保其长度满足20 µm的要求。
   1. 在电子表格中记录净素刺激后膜突起在后续形成分支的区域开始出现时的帧数，以及新生分支在净素刺激后长度达到 20 µm 时的帧数。
   2. 将突出形成与分支形成之间的帧数乘以 20 秒，以计算每个分支的形成时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底活细胞成像培养皿	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	必须使用 1 mg/mL 多聚赖氨酸（Poly-d-lysine）包被，并在接种细胞前进行冲洗
Olympus IX81-ZDC2 倒置显微镜	Olympus
Lambda LS 氙灯	Sutter Instruments Company
台式环境培养箱	Tokai Hit
100× 1.49 NA TIRF 物镜	Olympus
Andor iXon EM-CCD 相机	Andor
Odyssey Licor 近红外成像系统	LI-COR	Odyssey CL-X	用于扫描印迹膜
Image Studio 软件套件	LI-COR		用于在 Odyssey 近红外系统上进行扫描；Image Studio Lite 用于印迹膜的离线分析
Metamorph for Olympus 软件	Molecular Devices, LLC	版本 7.7.6.0	用于所有成像及 DIC 时间序列图像的分析
CELL TIRF 控制软件	Olympus		用于控制 TIRF 成像的激光器
Fiji（ImageJ）	NIH	ImageJ 版本 1.49t
60× 平场复消色差 1.4 NA 物镜	Olympus
40× 1.4 NA 平场复消色差物镜	Olympus
Neurobasal 培养基	GIBCO	21103-049	无血清培养基和胰酶中和培养基的基础溶液
B27 补充剂	GIBCO	17504-044	每 500 mL 培养基中加入 50 mL，用于无血清培养基和胰酶中和培养基
L-谷氨酰胺		35050-061	每 50 mL 无血清培养基中加入 1 mL
胎牛血清	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Corning/CELLGRO	20-021-CV
多聚赖氨酸（Poly-D-Lysine）	Sigma	p-7886