活体双光子成像观察小鼠海马区小胶质细胞动态

摘要

来源： Kamei, R. 等, 体内 小鼠海马区小胶质细胞的慢性双光子成像 视频实验杂志 (2022)

该视频展示了活体海马体CA1区（Cornu ammonis 1）和齿状回中小胶质细胞动态的双光子显微成像的设置与成像过程，确保了最佳的光学对准以及结构完整性的评估。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 利用 CX3CR1-GFP 小鼠进行体内小胶质细胞的长期双光子成像

1. 麻醉诱导后，用无菌生理盐水冲洗金属管内部以去除碎屑。确保通过玻璃能够观察到海马的白色齿状回图1A且无术后出血等并发症。
2. 按照以下步骤将小鼠置于双光子显微镜下：
   1. 将小鼠置于双光子显微镜物镜下、电动XY扫描载物台上的头部固定装置中，使用加热垫维持体温。监测并调整麻醉深度，因该质量检查过程可能持续长达30分钟。 注意： 建议使用工作距离（WD）大于 3 mm 且数值孔径（NA）较高的水浸物镜。通过校正物镜上的校正环，可补偿玻璃与生物材料之间折射率的不匹配，从而提高分辨率。
   2. 在玻璃和物镜之间注满水，需特别注意避免产生气泡。如有必要，可使用能容纳更多水的塑料薄膜扩大金属板的面积，以完全覆盖物镜的整个前透镜。
   3. 打开波长为920 nm的飞秒脉冲激光器，用于激发脑内表达的荧光探针，并启动图像采集软件。
   4. 使用电动载物台和电动调焦系统将焦距调整至CA1区（Cornu Ammonis 1）。在脉冲激光持续照射下，根据脑实质发出的荧光以及金属管边缘反射光的引导，定位目标结构。
   5. 通过使用电动调焦系统调节焦距，测量脑实质接触玻璃底的不同深度。比较不同水平位置处的深度，以判断玻璃底面与成像平面的对齐情况。
      1. 通过倾斜头部固定装置来调整小鼠头部的角度，直至玻璃底部与成像平面平行。
   6. 调整物镜的校正环，以在CA1目标结构的深度处获得最高分辨率。
3. 通过双光子激发海马体获得的图像质量与强度检查图1B).
   注意： 图像退化表明脑内存在组织损伤。
4. 确保小胶质细胞已恢复其分枝状形态（图1C).
   注意： 小胶质细胞的成像数据显示，小胶质细胞至少需要3-4周才能恢复到基础状态。
5. 执行 体内 为实验的特定目的对CA1的任何层进行成像。

结果

图1： 在体 慢性期CX3CR1-GFP小鼠小胶质细胞成像 (A右侧背侧CA1区（Cornu Ammonis 1）植入窗在慢性期的典型外观。通过玻璃底端可清晰观察到alveus的白质纤维，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
飞秒脉冲激光器	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	在920 nm波长下使用的钛宝石激光器。
双光子显微镜	Nikon	A1R MP+	用于CA1成像的显微镜。
双光子成像用物镜	Olympus	XLPLN25XSVMP	具有长工作距离、高数值孔径和校正环的25×物镜
铝板	Narishige	CP-1	用于头部固定的铝制板。
圆形玻璃盖玻片	Matsunami Glass	3φ No.1	粘附在不锈钢管上的盖玻片。
CX3CR1-GFP小鼠	The Jackson Laboratory	8451	用于小胶质细胞成像的转基因小鼠。
圆柱形不锈钢管	MORISHITA	定制	用于植入的金属管。外径3.0 mm，内径2.8 mm，高度1.7 mm。
牙科树脂粘接剂（Super-Bond C&B）	Sun Medical	204610555	牙科粘接剂。
头部固定装置	Narishige	MAG-2	带有角度调节器的小鼠头部固定装置
加热垫	Bio Research Center	BWT-100A 和 HB-10	在手术期间为小鼠提供保温支持的工具。
加热垫	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 和 Hot-1	在头部固定装置上为小鼠提供保温支持的工具。
氯胺酮（Ketalar）	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	手术期间的麻醉剂。
眼用软膏	Sato Pharmaceutical		用于防止手术期间眼睛干燥。
聚维酮碘外科洗手液	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	用于手术部位的消毒。
体视显微镜	Leica Microsystems	S8 APO	用于手术的显微镜。
无菌生理盐水	Otsuka Pharmaceutical Factory	3311401A2026	手术期间的冲洗液。
无菌防水垫	AS ONE	8-5945-01	手术平台。
赛拉嗪（Celactal 2%）	Bayer		手术期间的麻醉剂。