小鼠海马体小胶质细胞动力学的体内双光子成像

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1.使用CX3CR1-GFP小鼠对小胶质细胞进行体内慢性双光子成像

1. 导后，用无菌盐水清洗金属管内部以去除碎屑。确保通过玻璃可以看到海马体的白色肺泡（图1A），并且没有并发症，例如术后出血。
按
2. 以下步骤将鼠标设置在双光子显微镜下：
   将
   1. 鼠标设置在双光子显微镜物镜下方的头部固定装置中，并设置在电动XY扫描台上。使用加热垫进行热支撑。监测和调整麻醉深度，因为此质量检查可能需要长达 30 分钟。注意： 建议使用工作距离 （WD） 长于 3 mm 且数值孔径 （NA） 较高的水浸式物镜。物镜的校正环可以通过补偿玻璃和生物材料之间的折射率不匹配来提高分辨率。
   用
   2. 水填充玻璃和物镜之间的空间，特别注意避免气泡。如有必要，使用可容纳更多水的塑料薄膜扩大金属板的面积，以覆盖物镜的整个前镜头。
   打开波
   3. 长为920nm的飞秒脉冲激光器，激发大脑中表达的荧光探针，启动图像采集软件。
   4. 使用电动载物台和电动对焦系统将焦点调整到 CA1 （Cornu Ammonis 1）。在脉冲激光的连续照明下，在脑实质发出的荧光和金属管边缘的反射光的引导下定位目标结构。
   5. 通过使用电动对焦系统调整焦点来测量接触玻璃底部的脑实质的深度。比较不同水平位置的深度，判断玻璃底部和成像平面的对齐情况。
      1. 通过倾斜头固定装置来调整鼠标头的角度，直到玻璃底部设置为平行于成像平面。
   6. 调整物镜的校正环，以在CA1中目标结构的深度处获得最高分辨率。
3. 检查通过海马体双光子激发获得的图像的质量和强度（图1B）。
   注意：图像恶化表明大脑内存在组织损伤。
4. 确保小胶质细胞已经恢复其分支形态（图1C）。
   注意：小胶质细胞的成像数据表明，小胶质细胞至少需要3-4周才能恢复到其基础状态。
5. 出于实验的特定目的，在CA1的任何层中进行体内成像。

图1： 慢性期CX3CR1-GFP小鼠小胶质细胞的体内成像。（一个） 慢性期右背侧 CA1 （Cornu Ammonis 1） 上植入窗口的代表性外观。透过玻璃底，可以清楚地观察到肺泡的白色纤维，没有术后出血。DHC 和 LV 分别在尾内侧区域和喙外侧边缘部分可见。比例尺，1 mm。（B）来自POD 24上CX3CR1-GFP小鼠的体内慢性CA1成像的代表性3D重建（宽度：511μm，高度：511μm，深度：670μm）。（C）来自（B）的小胶质细胞的典型图像具有完全恢复的分支形态，显示为距手术表面100,280和500μm深度的厚度为20μm的GFP图像堆栈的MIP。比例尺，50 μm。