利用共聚焦显微镜成像小鼠神经末梢中的快速钙瞬变

摘要

来源：Zhilyakov, N. V. 等，使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了利用共聚焦显微镜记录神经末梢快速钙瞬变的成像技术。通过刺激神经并捕捉钙结合染料的荧光变化，可直观显示神经末梢处钙离子的动态内流与清除过程，从而精确揭示突触活动及神经-肌肉信号传递的机制。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

实验在 BALB/C 小鼠（20-23 g，2-3 月龄）的levator auris longus（m. LAL）离体神经-肌肉标本上进行。

1. 林格氏液与填充液的制备

1. 通过混合以下成分来配制哺乳动物肌肉用的任氏液：氯化钠（NaCl，137 mM）、氯化钾（KCl，5 mM）、氯化钙（CaCl₂，2 mM）、氯化镁（MgCl₂，1 mM）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄，1 mM）、碳酸氢钠（NaHCO₃，11.9 mM）和葡萄糖（11 mM）。用95%氧气（O₂）和5%二氧化碳（CO₂）混合气体持续通入溶液，并在必要时通过添加盐酸/氢氧化钠（HCl/NaOH）将pH值调节至7.2–7.4。
2. 配制染料负载溶液。
   1. 配制pH为7.2–7.4的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，10 mM）溶液。市售染料每瓶500 µL含500 µg。将染料溶于14 µL HEPES溶液中，得到浓度为30 mM的染料溶液。充分振荡并离心至完全溶解。
   2. 用HEPES溶液将Ca²⁺指示剂溶液稀释至1 mM浓度。保存于冷冻箱（-20 °C），避免光照。

2. 染料加载步骤

注意：染料加载操作按照通过神经残端加载的方案进行，该方案改编自先前发表的方案。

1. 根据先前已发表方案中所述的制备方法，解剖LAL肌肉。
   1. 用精细的不锈钢针将组织在涂有弹性体的培养皿中轻微拉伸固定（拉伸不超过初始长度的30%），并加入任氏液直至完全浸没肌肉。
      注意： 培养皿已按照制造商说明预先填充弹性体（见材料表）。
2. 制备填充移液管
   1. 使用微量移液管拉制仪（见材料表），制备用于细胞内记录的尖端尽可能细锐的微移液管。使用无内丝毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 或 1.10 mm）。
   2. 用研磨法在锥形部分划痕后折断移液管尖端，使尖端开口直径约为100 µm。进行火焰抛光，使内部直径从>80 µm缩小至12–13 µm。将一段硅胶管连接到填充移液管的一端，另一端连接注射器（不带针头）。
3. 在体视显微镜下，找到神经干分出独立神经分支的位置。用石蜡将装有硅胶管和注射器的填充移液管固定于培养皿上。移动移液管尖端，使其位于神经上方。
4. 使用精细剪刀在靠近肌纤维处剪断神经，保留约1 mm长的小段神经残端。轻柔地将神经残端连同部分任氏液一起吸入填充移液管尖端，注意不要夹压神经。从填充移液管上取下硅胶管。
5. 使用带有长丝状物的注射器吸取一定量染料负载溶液（约0.3 µL）。该体积相当于丝状物长度约3 cm。
   注意： 初始需使用酒精灯或气体燃烧器加热拉制10 µL移液管尖端，制成丝状物。
6. 将带有负载溶液的丝状物尖端轻轻插入填充移液管中，将混合物直接释放至神经残端上。将标本在室温避光条件下孵育30分钟。
7. 之后，用新鲜任氏液冲洗标本，并将其置于盛有50 mL（或更多）任氏液的玻璃烧杯中，在25 °C下孵育最多2小时（标本必须完全浸没于溶液中）。在此期间，染料将到达突触部位。

3. 共聚焦显微镜视频采集

注意： 钙瞬变的记录使用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行（参见材料表）。为了记录快速的钙瞬变，采用了一种原创性方案，可实现具有足够空间和时间分辨率的信号记录。显微镜配备了一个20倍水浸物镜（数值孔径（NA）为1.00）。488 nm激光线衰减至10%强度，发射荧光收集范围为503至558 nm。

1. 将制备好的样品置于硅胶弹性体包被的实验腔内，用一组钢制微针将其固定，并轻微拉伸。用任氏液对样品进行充分冲洗。
   注意： 一种简易的自制灌流实验腔室，由有机玻璃制成，腔室底部覆盖有弹性体（按说明书要求制备；参见 材料表使用了带有溶液供给管的腔室。溶液被泵出 通过 安装在磁性支架上的注射器针头（参见 材料列表）。作为实验腔室，可以使用培养皿（与用于孵育标本的培养皿相同），但需连接供液管和吸液管。
2. 安装一个用于刺激神经的吸引电极。
   注意： 将电极用石蜡固定在浴槽旁。移动电极尖端靠近神经残端，并将其吸入电极内。
3. 将灌流 chamber 安装到显微镜载物台上，并将进液和出液接头放入 chamber 中。
4. 使用简单的重力驱动灌流系统进行灌流。打开灌流吸引泵以去除多余的溶液。
5. 将刺激用的吸吮电极插入电刺激器中，并确保刺激后出现肌肉收缩。有关刺激条件和记录方法，请参见第3.9–3.12节。
6. 用含筒箭毒碱（10 µM）的任氏液灌注灌流系统。
   注意： 该溶液有助于防止肌肉收缩。使用突触后膜上烟碱型乙酰胆碱受体的特异性阻断剂，如D-筒箭毒碱或α-银环蛇毒素，可完全或部分抑制肌肉收缩50。此外，为防止肌肉收缩，也可使用突触后钠通道的特异性阻断剂，例如μ-芋螺毒素GIIIB51。
7. 打开灌流吸引泵，开始用含有d-筒箭毒碱的任氏液对制备样本进行灌流。
8. 在LSCM软件中按如下设置成像参数。
   1. 在LSCM软件（LAS AF；参见 材料表），选择 电生理学.
      注意： 在此模式下，当时间点采集图像时，触发盒会向刺激器发送同步脉冲，从而诱导标本产生动作电位。图1；刺激器单元）。
   2. 选择 采集模式通过显微镜同步脉冲触发刺激器时，在 工作 菜单设置，选择 触发 设置。设定 帧触发输出 字段到 输出1 通道
   3. 使用以下设置： 扫描模式：XYT， 扫描频率：1400 Hz， 变焦倍数: 6.1, 针孔：完全打开。确保已开启顺序双向X模式。
   4. 将形成一帧的最短时间设为52 ms，原始视频中采集的帧数设为20帧。
      注意： 这些设置允许以128 × 128像素的分辨率进行图像采集，每52 ms采集一帧。
   5. 将氩激光的激发波长设置为488 nm，输出功率为8%。

按下 实时模式 按钮以切换至实时模式，该模式有助于预览被染料标记的神经末梢。

9. 刺激单元
   注意： 该设备可用于设置刺激的时间参数 通过 MATLAB 软件
   1. 新建一个文件，将上述文章中的代码粘贴到 MATLAB 代码窗口中，并保存文件。点击 运行，此时会出现一个包含刺激参数的窗口。设置刺激的延迟时间和持续时间。
      注意： 延迟决定了重建荧光信号的时间分辨率。持续时间为0.2 ms的电脉冲被延迟后，送入隔离单元。该单元调节刺激脉冲的幅度和极性，并将生物样本与记录设备进行电学隔离。
   2. 为刺激神经，应选择超最大刺激强度的刺激脉冲幅度（比激活全部神经纤维所需的最大刺激强度高25%–50%）。
      注意： 所提出的方法基于一种特殊算法，利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以最小化扫描时间的方式记录单个快速荧光信号。在该算法的每一步中，所记录的荧光信号相对于前一次信号的时间偏移量均短于显微镜的扫描周期。时间偏移量的大小决定了所需信号的时间分辨率。算法中的步骤数（即偏移次数）取决于所需的时间分辨率和原始时间分辨率。采用该记录方法时，对样品的刺激频率为0.25 Hz。
10. 在实时模式下，搜索目标区域并获得最佳焦距。运行数据采集软件。
11. 将刺激器的延迟相对于先前值减少 2 ms，并运行数据采集软件。
12. 重复步骤 3.11 共 26 次，以获取 26 组序列，每次序列相对于前一次偏移 2 ms。

结果

图1：实验装置示意图。1. 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）。2. LSCM的同步模块（触发盒）。3. 刺激器。4. 隔离单元。5. 生物样本。6. 用于神经电刺激的吸附电极。7. 灌流系统（7a：灌流液储液瓶，7b：滴液管，7c：流量调节器，7d：真空抽滤瓶）。箭头指示同步脉冲传播的方向。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
毛细玻璃管	Clark Electromedical instruments, 英国	GC150-10
共聚焦与多光子显微镜系统 Leica TCS SP5 MP	Leica Microsystems, 海德堡, 德国
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 P-97	Sutter Instrument, 美国	P-97
流量调节器	KD Medical GmbH Hospital Products, 德国	KD REG	带流量调节器的一次性输液套件
HEPES	Sigma-Aldrich, 美国	H0887	100 mL
照明系统 Leica CLS 150X	Leica Microsystems, 德国
带吸液管的磁性固定架	BIOSCIENCE TOOLS, 美国	MTH-S
Microspin FV 2400	Biosan, 拉脱维亚	BS-010201-AAA
微型固定针	Fine science tools, 加拿大	26002-20
Multi-spin MSC 3000	Biosan, 拉脱维亚	BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 五钾盐	Molecular Probes, 美国	O6806	500 μg
移液器	Biohit, 俄罗斯	720210	0.5–10 µL
移液器吸头	Biohit, 俄罗斯	781349	10 µL
橡皮泥	本地生产商
一次性皮下注射针头	Bbraun	100 Sterican	0.4×40 mm
电子表格程序	Microsoft, 美国	Microsoft Office Excel
体视显微镜 Leica M80	Leica Microsystems, 德国
吸出电极			http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 弹性体	Dow Corning, 美国
注射器	本地生产商		0.5 mL
注射器	本地生产商		60 mL