利用共聚焦显微镜成像小鼠神经末梢中的快速钙瞬变

摘要

来源：Zhilyakov, N. V. 等，使用共聚焦显微镜以高时间分辨率记录小鼠神经肌肉接头中的钙瞬变。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了利用共聚焦显微镜记录神经末梢快速钙瞬变的成像技术。通过刺激神经并捕捉钙结合染料的荧光变化，可直观显示神经末梢处钙离子的动态内流与清除过程，从而精确揭示突触活动及神经-肌肉信号传递的机制。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

实验在 BALB/C 小鼠（20-23 g，2-3 月龄）的levator auris longus（m. LAL）离体神经-肌肉标本上进行。

1. 林格氏液与填充液的制备

1. 通过混合以下成分来配制哺乳动物肌肉用的任氏液：氯化钠（NaCl，137 mM）、氯化钾（KCl，5 mM）、氯化钙（CaCl₂，2 mM）、氯化镁（MgCl₂，1 mM）、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄，1 mM）、碳酸氢钠（NaHCO₃，11.9 mM）和葡萄糖（11 mM）。用95%氧气（O₂）和5%二氧化碳（CO₂）混合气体持续通入溶液，并在必要时通过添加盐酸/氢氧化钠（HCl/NaOH）将pH值调节至7.2–7.4。
2. 配制染料负载溶液。
   1. 配制pH为7.2–7.4的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，10 mM）溶液。市售染料每瓶500 µL含500 µg。将染料溶于14 µL HEPES溶液中，得到浓度为30 mM的染料溶液。充分振荡并离心至完全溶解。
   2. 用HEPES溶液将Ca²⁺指示剂溶液稀释至1 mM浓度。保存于冷冻箱（-20 °C），避免光....

结果

图1：实验装置示意图。1. 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）。2. LSCM的同步模块（触发盒）。3. 刺激器。4. 隔离单元。5. 生物样本。6. 用于神经电刺激的吸附电极。7. 灌流系统（7a：灌流液储液瓶，7b：滴液管，7c：流量调节器，7d：真空抽滤瓶）。箭头指示同步脉冲传播的方向。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
毛细玻璃管	Clark Electromedical instruments, 英国	GC150-10
共聚焦与多光子显微镜系统 Leica TCS SP5 MP	Leica Microsystems, 海德堡, 德国
Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 P-97	Sutter Instrument, 美国	P-97
流量调节器	KD Medical GmbH Hospital Products, 德国	KD REG	带流量调节器的一次性输液套件
HEPES	Sigma-Aldrich, 美国	H0887	100 mL
照明系统 Leica CLS 150X	Leica Microsystems, 德国
带吸液管的磁性固定架	BIOSCIENCE TOOLS, 美国	MTH-S
Microspin FV 2400	Biosan, 拉脱维亚	BS-010201-AAA
微型固定针	Fine science tools, 加拿大	26002-20
Multi-spin MSC 3000	Biosan, 拉脱维亚	BS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 五钾盐	Molecular Probes, 美国	O6806	500 μg
移液器	Biohit, 俄罗斯	720210	0.5–10 µL
移液器吸头	Biohit, 俄罗斯	781349	10 µL
橡皮泥	本地生产商
一次性皮下注射针头	Bbraun	100 Sterican	0.4×40 mm
电子表格程序	Microsoft, 美国	Microsoft Office Excel
体视显微镜 Leica M80	Leica Microsystems, 德国
吸出电极			http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 弹性体	Dow Corning, 美国
注射器	本地生产商		0.5 mL
注射器	本地生产商		60 mL