使用共聚焦显微镜对小鼠神经末梢中的快速钙瞬变进行成像

所有涉及动物样本的程序都经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

对来自小鼠BALB/C（20-23 g，2-3个月大）的耳提肌（m. LAL）的分离神经肌肉制剂进行了实验。

1. 林格氏液和锉刀液的制备

1. 通过混合以下成分制备哺乳动物肌肉林格氏液：氯化钠、NaCl （137 mM）、氯化钾、KCl （5 mM）、氯化钙、CaCl₂ （2 mM）、MgCl₂ （1 mM）、NaH₂PO₄ （1 mM）、NaHCO₃ （11.9 mM） 和葡萄糖 （11 mM）。用 95% 氧气 （O₂） 和 5% 二氧化碳 （CO₂） 在溶液中起泡，必要时通过添加盐酸/氢氧化钠 （HCl/NaOH） 将其 pH 值调节至 7.2-7.4。
2. 制备染料上样溶液。
   1. 制备 pH 值在 7.2-7.4 范围内的 （4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） （10 mM） 溶液。500 μg 商业染料装在 500 μL 小瓶中。将染料溶解在14μL的HEPES溶液中，以获得30mM的染料浓度。摇匀并离心直至完全溶解。
   用
   2. HEPES溶液将Ca^{2 +}指示剂溶液稀释至1 mM浓度。将其保存在冰箱 （-20 °C） 中，避免暴露在光线下。

2. 染料加载程序

：染料加载程序是根据通过神经残端加载的方案执行的，该方案改编自先前发布的方案。

1. 根据先前发布的方案中所述的该制剂的解剖程序解剖 LAL 肌肉。
   1. 用细不锈钢销将稍微拉伸的组织固定在涂有弹性体的培养皿中（不超过初始长度的30%），并加入林格氏溶液，直到肌肉完全覆盖。
      注意：培养皿根据制造商的说明预填充弹性体（参见 材料表）。
2. 准备灌装移液器
   1. 使用微量移液器拉拔器（参见 材料表），准备一个具有尽可能锋利的细尖端的微量移液器，用于细胞内记录。使用没有内丝的毛细管（外径 1.5 毫米，内径 0.86 或 1.10 毫米）。
   2. 用磨料在锥度上划线后折断微量移液器吸头，使吸头打开至直径约100μm。当内径从 >80 μm 缩小到 12-13 μm 时，将尖端向下火抛光以限制。将硅胶管连接到灌装移液器的一侧，将注射器（不带针头）连接到另一侧。
3. 在立体显微镜下，找到神经干变成独立神经分支的地方。使用蜡将装有管子的填充移液器和注射器放在培养皿上。移动移液器吸头，直到它位于神经上方。
4. 用细剪刀剪开靠近肌纤维的神经，留下一小块约1毫米长的神经残端。将神经残端与一些林格氏溶液一起轻轻吸出，不要捏住它，进入填充移液器的尖端。从灌装移液器上取下硅胶管。
5. 使用带有长丝的注射器抽取一定量的染料上样溶液（~0.3μL）。该体积对应于灯丝的大约 3 厘米。
   注意：最初，需要使用酒精灯或燃气燃烧器拉动火，从移液器吸头制成体积为 10 μL 的灯丝。
将
6. 装有装载溶液的灯丝尖端轻轻插入灌装移液器。将混合物直接释放到神经残端上。将制剂在室温下在黑暗中孵育30分钟。
7. 之后，用新鲜的林格氏溶液冲洗制剂，并在25°C下在装有50mL（或更多）林格氏溶液的玻璃烧杯中孵育长达2小时（制剂必须用溶液覆盖）。在此期间，染料将到达突触。

3.用共聚焦显微镜拍摄视频注意

：钙瞬变的配准是用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）进行的（参见 材料表）。为了记录快速钙瞬变，使用了一种原始协议，允许以足够的空间和时间分辨率记录信号。显微镜配备了 20 倍水浸物镜（1.00 数值孔径 （NA））。将488 nm激光线衰减至10%强度，并收集503至558 nm的发射荧光。

1. 将制剂安装到硅弹性体涂层的实验室中，并用一组钢制微针将其固定，稍微拉伸。用林格氏溶液彻底冲洗制剂。
   注意：使用了一个由有机玻璃制成的简单定制灌注实验室，腔室底部覆盖有弹性体（根据制造商的说明制备，参见 材料表）。腔室有一个溶液供应管。溶液通过安装在磁性支架上的注射器针头泵出（参见 材料表）。作为实验室，可以使用培养皿（如用于培养制剂的培养皿），但带有连接的供应管和抽吸管。
2. 安装一个抽吸电极，用于刺激神经。
   注意：在浴缸旁边打蜡，放置并固定电极。将尖端靠近神经残端并将其吸入电极中。
将
3. 制备室安装到显微镜载物台上，并将入口和出口配件放入室中。
4. 要灌注制剂，请使用简单的重力流驱动系统。打开灌注抽吸泵以去除多余的溶液。
将
5. 刺激吸力电极插入电刺激器，确保刺激后发生肌肉收缩。有关刺激条件和记录，请参阅第 3.9-3.12 节。
6. 用含有d-管箭毒碱（10μM）的林格氏溶液填充灌注系统。
   注意：该溶液有助于防止肌肉收缩。突触后膜上烟碱乙酰胆碱受体的D-管箭毒碱或α-bungarotoxin特异性阻滞剂将完全或部分阻断肌肉收缩50。此外，为了防止肌肉收缩，可以使用突触后钠通道的特异性阻滞剂，例如μ-conotoxin GIIIB51。
打开
7. 灌注抽吸泵，开始用含有 d-tubocurarine 的林格氏溶液灌注制剂。
在
8. LSCM软件中设置成像参数如下。
   1. 在 LSCM 软件（LAS AF;参见 材料表）中，选择 Electrophysiology.
      注意：在此模式下，当在时间点捕获图像时，同步脉冲会在触发盒的帮助下发送到刺激器。这会在制剂中产生动作电位（图1;刺激器单元）。
   2. 选择采集模式。要使用显微镜同步脉冲触发刺激器，请在"作业"菜单设置中选择"触发"设置。将 帧上触发输出（Trigger Out On Frame） 字段设置为 out1 通道。
   3. 使用以下设置：扫描模式：XYT，扫描频率：1400 Hz，变焦系数：6.1，针孔：全开。确保顺序跨通双向 X 模式处于打开状态。
   4. 将形成帧的最短时间设置为 52 毫秒，将原始视频中收集的帧设置为 20 帧。
      注意：这些设置允许以 128 x 128 像素的分辨率捕获图像，同时每 52 毫秒拍摄一帧。
   将
   5. 氩激光器的激发波长设置为 488 nm，输出功率为 8%。

按实时模式按钮切换到实时模式，这有助于预览装有染料的神经末梢。

9. 刺激单元
   注意：该设备允许通过 MATLAB 软件设置刺激的时间参数。
   1. 创建一个新文件，将上述文章中的代码粘贴到 MatLab 代码窗口中，然后保存该文件。单击运行，因此会出现一个包含刺激参数的窗口。设置刺激的延迟时间和持续时间。
      注意：延迟决定了重构荧光信号的时间分辨率。持续时间为 0.2 毫秒的电脉冲被延迟，然后发送到隔离单元。后者形成刺激脉冲的幅度和极性，并将生物物体与记录设备电隔离。
   2. 为了刺激神经，选择刺激冲动的超最大幅度（比激活所有神经纤维所需的最大刺激强度大25%-50%）。
      注意：所提出的方法基于一种特殊算法，用于使用LSCM记录单个快速荧光信号，并具有最小的扫描。在所开发算法的每一步中，记录的荧光信号都会从前一个信号偏移比显微镜扫描短的时间间隔。时移值决定了所需信号的时间分辨率。算法中的步数（移位）取决于所需的时间分辨率和原始时间分辨率。使用这种注册方法，以 0.25 Hz 的频率对制剂进行刺激。
10. 在实时模式下，搜索投资回报率并获得最佳焦点。运行数据采集软件。
将
11. 刺激器上的延迟相对于前一个值减少 2 毫秒，然后运行数据采集软件。
12. 重复步骤3.11 26次，获取26个序列，每个序列与前一个序列相距2 ms。

图 1：实验设置的示意图。 1.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）。2、LSCM（触发盒）同步模块。3. 刺激器。4、隔离单元。5. 生物样品。6.用于神经电刺激的抽吸电极。7. 灌注系统（7a：灌注液储液器，7b：滴管，7c：流量调节器，7d：保温瓶）。箭头指向同步脉冲的传播方向。