使用落射荧光显微镜对膝状神经节神经元反应进行活体成像

摘要

来源：Fowler, B. E., et al. 味觉刺激下小鼠膝状神经节神经元反应的活体钙成像。J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了一种在麻醉小鼠中将味觉刺激物递送至手术暴露的膝状神经节，并利用GCaMP荧光结合落射荧光显微镜实时观察神经元反应的实验方案，有助于外周味觉信号处理的相关研究。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 运行味觉刺激物筛选面板
   1. 用吸液法清除膝状节上方的液体。可选择放置吸水尖以减少渗漏，并辅助显微镜下操作导航。
   2. 将动物置于显微镜下的吸水垫上。定位膝状神经节：有用的解剖标志包括鼓室壁残留的孔洞、颞骨上的孔洞以及第七脑神经。使用落射荧光显微镜的FITC/GFP（异硫氰酸荧光素/绿色荧光蛋白）滤光片，检测表达GCaMP的单个膝状神经节神经元。使用10倍物镜（工作距离10 mm）即可获得足够的分辨率以追踪单个细胞的活动，但也可使用20倍物镜（工作距离12 mm）。
   3. 将味觉刺激液输送针头稳稳地放入动物口中，在动物口部下方放置培养皿以承接液体。
   4. 确保相机对准显微镜的视野。将视频录制的开始时间与呈递味觉刺激物的开始时间同步。
   5. 记录过程中，观察实时画面以监测反应、漂移和渗漏情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 带鲁尔锁的注射器	Fisher Scientific	14-823-30
27 号钝头分配针	Fisher Scientific	NC1372532
吸水尖头	Fisher Scientific	50-930-668
安赛蜜钾（Acesulfame K）	Fisher Scientific	A149025G
BD 过敏科托盘（带永久固定针头）	Fisher Scientific	14-829-6D
钝性牵开器	FST	18200-09
面包板	Thor Labs	MB8
定制头固定柱支架	eMachineShop		参见附件文件 202410.ems
定制金属头固定柱	eMachineShop		参见附件文件 202406.ems
直流温度控制器	FHC	40-90-8D
数字相机，sCMOS OrcaFlash4 显微镜安装型	Hamamatsu	C13440
解剖显微镜	Leica	M80
LED 冷光源	Leica Microsystems	KL300LED
鲁尔锁 1/16 英寸管路接头	Fisher	01-000-116
显微镜	Olympus	BX51WI
Mini-series 光学支架	Thorlabs	MS2R
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713A
加压空气	Airgas	AI Z300
自粘标签带	Fisher Scientific	159015R
硅胶夹管阀管路，1/32 英寸 × 1/16 英寸外径（每英尺）	Automate Scientific	05-14
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	25111
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91460-11
外科探针	Roboz Surgical Store	RS-6067
外科探针支架	Roboz Surgical Store	RS-6061
BD Intramedic 管路	Fisher Scientific	22-046941
两级气体调压器	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon 聚氯乙烯管路 - 1/16 英寸	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 数字/手动控制器	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 夹管阀灌流系统	Automate Scientific	17-pp-54
赛拉嗪（Xylazine）	Anased	NADA# 139-236