分析跨越 Drosophila 腹髓各层与各列的树突形态

摘要

来源：Ting, C., 等, 分析柱状与层状结构中的树突形态学。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了制备 果蝇 在共聚焦显微镜下采集脑组织中GFP标记的髓质树突的水平面与冠状面图像序列，并进行三维重建，以分析其在不同层和柱中的形态特征。

方案

1. 双图像采集

注意：此步骤旨在以两个正交（水平和冠状）方向获取目标神经元的两组图像序列。

1. 准备含有稀疏标记的髓质神经元（约每脑半球10个细胞）的果蝇脑组织，使用膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）标记物（mCD8GFP）。用兔抗GFP抗体（标记髓质神经元树突）和小鼠单克隆抗体mAb24B10（标记感光细胞轴突）作为一抗进行脑组织染色，并使用荧光二抗（Alexa 488标记的抗兔抗体和Alexa 568标记的抗小鼠抗体）进行检测。将脑组织置于含70%甘油的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中透明化处理。
2. 为将脑组织以水平方向封片（图1A、B），将经甘油透明化的果蝇脑转移至载玻片中央的20 µL抗荧光淬灭封片剂液滴中。
3. 在盖玻片的四个角上粘附小块黏土，以防止封片过程中盖玻片压碎脑组织样本。
   注意：黏土小块起到缓冲作用，避免盖玻片压碎样本。每个黏土小块直径应约为1 mm。
4. 在解剖显微镜下，将脑组织调整为腹面朝上的位置，并将盖玻片覆盖其上以固定脑组织。利用脑组织凸起的背侧表面作为解剖标志，确定脑样本的方向（图1A）。
5. 使用共聚焦显微镜获取第一组图像序列（水平视角）。采用高数值孔径物镜（如63X 1.3 N.A.甘油或油浸物镜），设置2.5倍数字放大（像素大小为0.105 µm/像素；平均扫描次数为2）。采集超过180....

结果

图1. 双视角成像的样品制备及Drosophila神经髓质柱状阵列的对称性。（A, B）用于双视角成像的样品安装。（A）视图示意为透过盖玻片观察脑组织。（B）样品安装的示意图。为获取水平方向的图像堆栈，首先将免疫标记的脑组织以腹面朝上位置安装；采集第一组图.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
软件
Huygens Professional	科学体积成像	版本 16.05	用于图像去卷积（https://svi.nl）的商业软件
MIPAV		7.3.0 版本	用于图像重组与配准（http://mipav.cit.nih.gov/.），免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class			免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class			免费软件
Imaris	Bitplane		用于神经突的追踪及为图像配准（http://www.bitplane.com）指定参考点的商业软件
Vaa3D			用于可视化 swc 文件（https://github.com/Vaa3D/release/releases/），免费软件
Matlab	Mathworks	R2014b	用于树突形态测量分析的商业软件（http://www.mathworks.com）
Matlab 工具箱：TREES1.14		v1.14	用于分析树突形态计量参数（http://www.treestoolbox.org/download.html）。免费软件
Matlab 工具箱：Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	用于计算形态计量参数（https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration）。免费软件
样本文件
SWC 文件定义			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
图像组合与配准的代码和示例文件			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/用于图像组合与标准化柱配准的数据集
参考点示例			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&修改日期=1471880596000&api=v2
计算机系统
MS Windows Windows 7 x64 或 Macintosh OS X 10.7 及更高版本			3GHz 64位四核处理器，16G内存（最低配置）
可选：Quadro4000（或更高版本）显卡	Nvidia		用于树突的立体可视化。
可选：NVIDIA 3D Vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
可选：适用于 NVIDIA 3D Vision2 的 120 Hz 液晶显示器			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
成像试剂
24B10 抗体	发育研究杂交瘤库	24B10
GFP标签抗体	赛默飞世尔科技	G10362
山羊抗兔（H+L），Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	A11034
山羊抗小鼠（H+L），Alexa Fluor 568	赛默飞世尔科技	A21124
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
固定用粘土	Fisher	S04179
1× PBS 中的 70% 甘油
盖玻片，高性能，直径=0.17mm	Zeiss	474030-9000-000