分析跨越 Drosophila 腹髓各层与各列的树突形态

摘要

来源：Ting, C., 等, 分析柱状与层状结构中的树突形态学。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了制备 果蝇 在共聚焦显微镜下采集脑组织中GFP标记的髓质树突的水平面与冠状面图像序列，并进行三维重建，以分析其在不同层和柱中的形态特征。

方案

1. 双图像采集

注意：此步骤旨在以两个正交（水平和冠状）方向获取目标神经元的两组图像序列。

1. 准备含有稀疏标记的髓质神经元（约每脑半球10个细胞）的果蝇脑组织，使用膜结合型绿色荧光蛋白（GFP）标记物（mCD8GFP）。用兔抗GFP抗体（标记髓质神经元树突）和小鼠单克隆抗体mAb24B10（标记感光细胞轴突）作为一抗进行脑组织染色，并使用荧光二抗（Alexa 488标记的抗兔抗体和Alexa 568标记的抗小鼠抗体）进行检测。将脑组织置于含70%甘油的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中透明化处理。
2. 为将脑组织以水平方向封片（图1A、B），将经甘油透明化的果蝇脑转移至载玻片中央的20 µL抗荧光淬灭封片剂液滴中。
3. 在盖玻片的四个角上粘附小块黏土，以防止封片过程中盖玻片压碎脑组织样本。
   注意：黏土小块起到缓冲作用，避免盖玻片压碎样本。每个黏土小块直径应约为1 mm。
4. 在解剖显微镜下，将脑组织调整为腹面朝上的位置，并将盖玻片覆盖其上以固定脑组织。利用脑组织凸起的背侧表面作为解剖标志，确定脑样本的方向（图1A）。
5. 使用共聚焦显微镜获取第一组图像序列（水平视角）。采用高数值孔径物镜（如63X 1.3 N.A.甘油或油浸物镜），设置2.5倍数字放大（像素大小为0.105 µm/像素；平均扫描次数为2）。采集超过180个光学切片（512 × 512像素），步长为0.2 µm，以完整覆盖髓质神经 Neuropil 区域。
6. 重新封片，但将脑组织调整为前部朝上的方向（正视视角）。
7. 对同一神经元采集第二组图像序列（正视视角）。
   注意：当视叶中标记了大量神经元时，识别同一神经元可能具有挑战性。为从两个方向准确匹配同一神经元，可能需要获取两个视角下的低倍图像序列（例如，使用0.7倍放大，步长0.45 µm，采集低分辨率图像序列）。若图像尺寸大于512 × 512，应在图像合并前裁剪至512 × 512，同时在拍摄大视野图像时保持像素大小为0.105 µm/像素。深层组织成像时可能出现信号衰减问题。若信号较弱，可优先成像脑组织的腹侧半部。为减少扫描过程中的光漂白，应尽可能使用最低的激光功率。在采集图像序列前，使用范围指示器检查是否存在过曝现象。如条件允许，建议使用配备GaAsP检测器的共聚焦显微镜。
8. 根据髓质神经 Neuropil 的位置，识别并记录目标神经元的位置（左右[R/L]和背腹[D/V]方向）。通过检查图像序列判断样本在成像过程中是否发生移动。
   注意：样本移动通常由封片不当引起。若发生样本移动，则该图像序列无法用于后续图像配准，应予以弃用。需重新封片并对同一神经元重新采集图像序列。

2. 图像去卷积

注意：去卷积步骤使用图像去卷积软件来恢复因模糊和噪声而质量下降的采集图像。虽然此步骤为可选，但它能显著提高图像质量。

1. 以交互模式启动去卷积程序。在主窗口中，通过选择菜单：文件/打开（或 Ctrl+O）来加载图像堆栈（lsm 或特定显微镜格式）。
2. 单击以选择已加载的图像堆栈，然后选择菜单：Ops 以打开图像操作窗口。使用默认的经典最大似然估计（CMLE）算法。
3. 在图像操作窗口中，单击“参数”选项卡。输入与物镜浸没介质相匹配的适当参数（例如， 油，甘油 等等。），包埋介质（例如， 浸油 等等），以及数值孔径（NA；此处使用1.3）。检查其余参数，确保其准确反映成像条件。点击“Set all verified”选项卡以完成参数设置。
4. 在图像操作窗口中，单击“操作”选项卡。指定输出目标（例如， c). 在“每通道信噪比”中输入适当的数值（例如， “12 12 12 12” 是一个合适的起始设置，而默认值为 “20 20 20 20”。其余参数采用默认设置。
5. 点击“运行命令”标签以开始解卷积图像堆栈；根据计算机性能不同，此过程可能需要数十分钟才能完成。
6. 在主窗口中，点击并选择去卷积后的图像堆栈。选择菜单：另存为，将去卷积后的图像以 ICS 图像文件格式（.ics 和 .ids）保存。
   注意： 每个图像堆栈包含两个文件：ics 文件包含头部信息，ids 文件包含原始图像数据。
   1. 根据成像方向重命名图像堆栈文件例如， 将水平视角的图像序列命名为 H.ids 和 H.ics，将正面视角的图像序列命名为 F.ids 和 F.ics。

3. 双视角图像组合

注意：此步骤使用 MIPAV 软件将两个图像堆栈合并，以生成高分辨率的三维图像。

1. 生成用于图像组合的矩阵。
   1. 启动 MIPAV 程序。通过选择菜单：文件/打开图像 (A) 从磁盘（或 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids 加载 H 和 F 图像序列；窗口将显示两幅图像。
   2. 点击 H 图像，选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度；窗口将显示 GrayG、GrayB 和 GrayR 图像。
   3. 关闭 GrayR 和 GrayB，仅在窗口中保留 GrayG。
   4. 点击 F 图像，选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度。窗口将显示 GrayG1、GrayB1 和 GrayR1 图像。
   5. 关闭 GrayR1 和 GrayB1，仅在窗口中保留 GrayG1。此时，窗口中仅保留 GrayG 和 GrayG1。
   6. 选中 GrayG（高亮），选择菜单：算法/配准/优化自动图像配准；“优化自动图像配准 3D”对话框将弹出。
      1. 在输入选项中，将“自由度”从默认的“Affine-12”更改为“Specific rescale-9”；在“旋转”中，“旋转角度采样范围”输入 -105 至 105（默认：-30 至 30 度），“粗角度增量”输入 10（默认：15 度），“细角度增量”输入 3（默认：6 度）。
   7. 点击确定。第一个矩阵“GrayG_To_GrayG1.mtx”将生成并保存在图像文件夹中。关闭所有图像窗口，进入下一步，此步骤至少需要 15 分钟。
   8. 通过选择菜单：文件/打开图像 (A) 从磁盘（或 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids，重新加载 H 和 F 图像序列。
   9. 点击图像选中 H 图像，选择菜单：工具/转换工具/RGB/灰度；“RGB->Gray”对话框将弹出。点击确定；窗口将显示“HGray”图像。保留 HGray 并关闭 H 图像。
   10. 对 F 图像重复步骤 3.1.9；窗口中将出现“FGray”图像。保留 FGray 并关闭 F 图像；此时窗口中仅保留 HGray 和 FGray。
   11. 选中 HGray 图像（高亮），进入菜单：算法/变换工具/变换。弹出“变换/重采样图像”对话框。点击“重采样”选项卡，将重采样尺寸从“HGray”更改为“FGray”。接着点击“变换”选项卡，通过选择“从文件读取矩阵”加载“GrayG_To_GrayG1.mtx”。点击确定；窗口将显示 HGray_transform 图像。关闭 HGray 图像，此时窗口中仅保留 HGray_transform 和 FGray。
   12. 选中“HGray_transform”图像（高亮），进入菜单：算法/配准/优化自动图像配准。弹出“优化自动图像配准 3D”对话框。在“旋转”中，“旋转角度采样范围”输入 -5 至 5（默认：-30 至 30 度），“粗角度增量”输入 3（默认：15 度），“细角度增量”输入 1（默认：6 度）。点击确定。
       注意：仿射矩阵（HGray_transform_To_FGray.mtx）将生成并保存在图像文件夹中，同时窗口中将显示“HGray_Transform_register”图像。此步骤至少需要 40 分钟。
   13. 关闭“HGray_transform”图像；此时窗口中仅保留“HGray_Transform_register”和“FGray”。
   14. 选中“HGray_Transform_register”图像（高亮），进入菜单：算法/配准/B-Spline 自动配准 2D/3D。弹出“B-Spline 自动配准-3D 强度”对话框。在代价函数中选择“最小二乘法”（默认为相关比）。
       1. 点击“执行两遍配准”。在第一遍部分，“梯度下降最小步长（采样单位）”输入 2（默认为 1），“最大迭代次数”输入 10（默认为 10）。在第二遍部分，“梯度下降最小步长（采样单位）”输入 1（默认为 0.5），“最大迭代次数”输入 2（默认为 10）。
          注意：非线性变换矩阵“HGray_transform_register.nlt”将保存在图像文件夹中，同时窗口中将显示“HGray_transform_register_registered”图像。此步骤至少需要 5 分钟。
   15. 关闭窗口中的所有图像。
2. 生成用于图像组合的参考图像。
   注意：此步骤旨在生成用于组合的已配准水平图像。
   1. 通过选择菜单：文件/打开图像 (A) 从磁盘（或 Ctrl-f）/H.ids 和 F.ids 加载 H 和 F 图像序列；窗口中将出现两幅图像。
   2. 选中 H 图像（高亮），进入菜单：算法/变换工具/变换；弹出“变换/重采样图像”对话框。点击“重采样”选项卡，将重采样尺寸从“H”更改为“F”。接着点击“变换”选项卡，通过选择“从文件读取矩阵”加载“GrayG_To_GrayG1.mtx”。点击确定；窗口中将出现 H_transform 图像。关闭 H 图像，保留 H_transform 和 F 在窗口中。
   3. 选中“H_transform”图像（高亮），进入菜单：算法/变换工具/变换；弹出“变换/重采样图像”对话框。点击“重采样”选项卡，将重采样尺寸从“H_transform”更改为“F”。接着点击“变换”选项卡，通过选择“从文件读取矩阵”加载“HGray_transform_To_FGray.mtx”。点击确定；窗口中将出现“H_transform_transform”图像。关闭 H_transform 图像；此时窗口中仅保留 H_transform_transform 和 F。
   4. 选中“H_transform_transform”图像（高亮），进入菜单：算法/变换工具/非线性变换；弹出“非线性 B-Spline 变换”对话框。加载“HGray_transform_register.nlt”并点击确定；窗口中将出现“H_transform_transform_registered”图像。将该图像保存为 ics 文件。关闭窗口中的所有图像。
3. 组合图像序列
   注意：此步骤将从正交方向（水平和前位）获取的两个图像序列合成为一个高分辨率图像序列。
   1. 进入菜单：插件/通用/Drosophila 视网膜配准；弹出“Drosophila 视网膜配准 v2.9”对话框。在图像 H 中上传“H.ics”，在图像 H-配准中上传步骤 3.2.4 的“H_transform_transform_registered”，在图像 F 中上传“F.ics”，在变换 1-绿色（可选）中上传步骤 3.1.7 的“GrayG_To_GrayG1.mtx”，在变换 2-仿射中上传步骤 3.1.12 的“HGray_transform_To_FGray.mtx”，在变换 3-非线性（可选）中上传步骤 3.1.14 的“HGray_transform_register.nlt”。
      1. 在“将 H 缩放至 F”中选择 SqRt(Intensity-H × Intensity-F) 和无缩放。其余参数保留默认设置。点击确定；此步骤约需 3 分钟。
         注意：处理完成后将生成三组图像：combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids（最终重组图像）、greenChannelsImage-Gxreg-Gy-Gcomp.IDS（H、F 和最终重组图像的绿色通道）和 redChannelsImage-Rxreg-Ry-Rcomp.ids（H、F 和最终重组图像的红色通道）；所有输出文件将被调整为 512 × 512 × 512。
   2. 在图像可视化软件中打开“combinedImage_sqrRt_trilinear_norescale_ignoreBG.ids”。将图像序列保存为 ims 格式并重命名文件；该重组图像文件将用于神经突追踪和配准。

4. 轴突追踪与参考点分配

注意：此步骤涉及使用图像可视化软件追踪神经突（4.1）并为配准分配参考点（4.2）。

1. 追踪神经突
   1. 启动图像可视化软件，打开重组后的图像文件。进入菜单：编辑/显示调整（Edit/Show Display Adjustment），关闭感光细胞通道（红色）。
   2. 以“Surpass”模式查看图像。若计算机配备立体成像系统，请开启“stereo”模式，并使用“Quad Buffer”模式观察三维图像。
   3. 进入菜单：Surpass/Filaments，添加新的纤维结构。点击“跳过自动创建，手动编辑”选项卡。
   4. 点击“绘制（Draw）”选项卡，选择“AutoDepth”模式。
   5. 选择“设置（Settings）”，勾选“线（Line）”，并输入合适的像素数值以优化可视化效果（本方案中使用4像素线宽）。勾选“显示树突（Show Dendrites）”、“起始点（Beginning Point）”和“分支点（Branching Points）”。将“渲染质量（Render Quality）”设置为100%。
   6. 选择“绘制（Draw）”选项卡，开始追踪神经突。首先追踪轴突，然后追踪树突（图1D）。转神经节细胞（Tm神经元）的轴突与树突易于区分。
      注意： Tm神经元从胞体发出轴突，并全程投射至高级视觉处理中枢——叶状体（lobula）。系统将自动将第一条长纤维识别为轴突，其余较短纤维识别为树突。追踪过程中，起始点应位于纤维（轴突）起始处，并确保所追踪的神经突相互连接。检查分支点和起始点；若树突未连接，系统将在未连接的纤维处定义新的起始点。
   7. 完成追踪后，返回“设置（Settings）”，取消勾选“起始点（Beginning Point）”和“分支点（Branching Points）”，进入菜单：Surpass/导出所选对象（Export selected objects../.）。将纤维结构保存为Inventor文件格式（*.iv）。

结果

图1. 双视角成像的样品制备及Drosophila神经髓质柱状阵列的对称性。（A, B）用于双视角成像的样品安装。（A）视图示意为透过盖玻片观察脑组织。（B）样品安装的示意图。为获取水平方向的图像堆栈，首先将免疫标记的脑组织以腹面朝上位置安装；采集第一组图...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
软件
Huygens Professional	科学体积成像	版本 16.05	用于图像去卷积（https://svi.nl）的商业软件
MIPAV		7.3.0 版本	用于图像重组与配准（http://mipav.cit.nih.gov/.），免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class			免费软件
MIPAV 插件：PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class			免费软件
Imaris	Bitplane		用于神经突的追踪及为图像配准（http://www.bitplane.com）指定参考点的商业软件
Vaa3D			用于可视化 swc 文件（https://github.com/Vaa3D/release/releases/），免费软件
Matlab	Mathworks	R2014b	用于树突形态测量分析的商业软件（http://www.mathworks.com）
Matlab 工具箱：TREES1.14		v1.14	用于分析树突形态计量参数（http://www.treestoolbox.org/download.html）。免费软件
Matlab 工具箱：Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	用于计算形态计量参数（https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration）。免费软件
样本文件
SWC 文件定义			http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html
图像组合与配准的代码和示例文件			https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/用于图像组合与标准化柱配准的数据集
参考点示例			https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&修改日期=1471880596000&api=v2
计算机系统
MS Windows Windows 7 x64 或 Macintosh OS X 10.7 及更高版本			3GHz 64位四核处理器，16G内存（最低配置）
可选：Quadro4000（或更高版本）显卡	Nvidia		用于树突的立体可视化。
可选：NVIDIA 3D Vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
可选：适用于 NVIDIA 3D Vision2 的 120 Hz 液晶显示器			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
成像试剂
24B10 抗体	发育研究杂交瘤库	24B10
GFP标签抗体	赛默飞世尔科技	G10362
山羊抗兔（H+L），Alexa Fluor 488	赛默飞世尔科技	A11034
山羊抗小鼠（H+L），Alexa Fluor 568	赛默飞世尔科技	A21124
VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂	Vector Laboratories	H-1000
固定用粘土	Fisher	S04179
1× PBS 中的 70% 甘油
盖玻片，高性能，直径=0.17mm	Zeiss	474030-9000-000