利用基于细胞的神经递质荧光工程报告系统成像神经递质释放

摘要

来源： Lacin, E., et al．用于体内神经递质光学检测的基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建．J. Vis. Exp. （2016）

本视频演示了一种利用基于细胞的神经递质荧光工程报告细胞（CNiFERs）在活体中成像神经递质释放的技术，其中特化的报告细胞已被预先注射到小鼠皮层中。将小鼠置于双光子显微镜下，可通过荧光发射观察神经递质诱导的钙信号。该方法利用神经递质与CNiFERs上的G蛋白偶联受体结合，触发钙离子释放及荧光信号，从而实时检测神经递质活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 将 CNiFER 植入小鼠皮层

1. 手术前将所有外科器械在高压灭菌器中灭菌。用70%乙醇擦拭并铺上洁净的实验用垫巾，以准备半无菌手术区域。
2. 使用垂直电极拉制仪将玻璃毛细管（内径为0.53 mm）拉制成CNiFER注射移液管。用一对5号尖头镊子将电极尖端折断，使其直径约为40 μm。
   注意： 这最好在带有刻度目镜的立体变倍显微镜下完成。
3. 使用异氟烷麻醉一只成年（出生后60-90天）C57BL/6小鼠：诱导浓度为4%（v/v），维持浓度为1.5%至2.0%（v/v）。通过尾部或足趾夹捏反应确认小鼠已完全麻醉。
   注意： 定期重新夹捏并评估手术过程中胡须抽动情况，以再次确认麻醉深度。
4. 用眼药膏覆盖眼睛以防止干燥。使用耳杆将小鼠固定在立体定位仪上。通过直肠探针调节的加热垫维持小鼠体温在37 °C。
5. 用动物专用电推剪剃除约5 mm × 12 mm区域的毛发。先涂抹贝塔碘，再用70%（v/v）异丙醇处理。使用手术刀片切开并去除颅骨表面的皮肤。用手术刀片刮除颅骨表面的骨膜。暴露并清洁颅骨表面，操作方法同立体定位手术所述。
6. 将空的玻璃移液管降至前囟，记录前后（A/P）和内侧-外侧（M/L）坐标。参照小鼠脑图谱，计算注射位点的位置。将移液管移至目标位点，并在颅骨上标记，....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氰基丙烯酸酯胶水	Loctite	Loctite no. 495	手术与立体定位注射
塑料石蜡膜	VWR	Parafilm®	手术与立体定位注射
NANOINJECTOR	Drummond	3-000-204	手术与立体定位注射
玻璃电极	Drummond	3-000-203G	手术与立体定位注射
手持式钻机	OSADA	Exl-M40	手术与立体定位注射
钻头磨头	Fine Scientific	19007-05; 19007-07	手术与立体定位注射
灭菌浴	FST	18000-45, Hot Bead Sterilizer	手术与立体定位注射
异氟烷麻醉舱/面罩	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm	手术与立体定位注射
带臂三维显微镜	Zeiss		手术与立体定位注射
光纤光源			手术与立体定位注射
聚维酮碘（Betadine）			手术与立体定位注射
70 % (v/v) 异丙醇			手术与立体定位注射
聚维酮碘消毒垫	dynarex	1108	手术与立体定位注射
0.9% 氯化钠注射液（INJECTION, USP, 918610）			手术与立体定位注射
环孢素注射液（CYCLOSPORINE, INJECTION, USP）			手术与立体定位注射
Buprenex（注射用）丁丙诺啡（每克啮齿类动物 0.03 μg）	Sigma		手术与立体定位注射
眼用软膏	Akorn	NDC 17478-235-35	手术与立体定位注射
Surgifoam	Ethicon		手术与立体定位注射
Grip 牙科水泥	Dentsply	#675571, 675572	手术与立体定位注射
Instant SuperGlue	NDindustries		手术与立体定位注射
LOCTITE 4041			手术与立体定位注射
METABOND	C&B		手术与立体定位注射
0 号盖玻片	Fisher		手术与立体定位注射
立体定位仪框架	Kopf		手术与立体定位注射
直肠探头与加热垫	FHC	40-90-8D, DC Temperature Controller, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad, 40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe	手术与立体定位注射
用于成像的光学面包板	Thorlabs		手术与立体定位注射
矿物油	Fisher	S55667	手术与立体定位注射
Kwik-Cast（硅胶弹性体）	World Precision Instruments		手术与立体定位注射
缝合线	Ethicon	18’’, 1667, 4-0	手术与立体定位注射
剪刀	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	手术与立体定位注射
镊子	Fine Scientific Tools	11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10	手术与立体定位注射
学生用 Halsted-Mosquito 止血钳	Fine Scientific Tools	91308-12	手术与立体定位注射
小血管电凝器套件	Fine Scientific Tools	18000-00	手术与立体定位注射
热珠灭菌器	Fine Scientific Tools	18000-45	手术与立体定位注射
带硅胶垫的器械盒	Fine Scientific Tools	20311-21	手术与立体定位注射
带硅胶垫的塑料灭菌容器	Fine Scientific Tools	20810-01	手术与立体定位注射
用于活体成像的双光子固定式显微镜	Olympus	FV1200 MPE	活体成像
多光子激光器	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	活体成像
绿色激光器	Olympus	473 nm Laser	活体成像
xy 平移底座	Scientifica	MMBP	活体成像
用于 YFP 和 CFP 的 FRET 滤光片组	Olympus		活体成像
25倍水浸物镜	Olympus		活体成像
气浮光学平台	Newport		活体成像
定制的避光屏蔽笼	Thorlab		活体成像