利用基于细胞的神经递质荧光工程报告系统成像神经递质释放

摘要

来源： Lacin, E., et al．用于体内神经递质光学检测的基于细胞的神经递质荧光工程报告系统（CNiFERs）的构建．J. Vis. Exp. （2016）

本视频演示了一种利用基于细胞的神经递质荧光工程报告细胞（CNiFERs）在活体中成像神经递质释放的技术，其中特化的报告细胞已被预先注射到小鼠皮层中。将小鼠置于双光子显微镜下，可通过荧光发射观察神经递质诱导的钙信号。该方法利用神经递质与CNiFERs上的G蛋白偶联受体结合，触发钙离子释放及荧光信号，从而实时检测神经递质活性。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 将 CNiFER 植入小鼠皮层

1. 手术前将所有外科器械在高压灭菌器中灭菌。用70%乙醇擦拭并铺上洁净的实验用垫巾，以准备半无菌手术区域。
2. 使用垂直电极拉制仪将玻璃毛细管（内径为0.53 mm）拉制成CNiFER注射移液管。用一对5号尖头镊子将电极尖端折断，使其直径约为40 μm。
   注意： 这最好在带有刻度目镜的立体变倍显微镜下完成。
3. 使用异氟烷麻醉一只成年（出生后60-90天）C57BL/6小鼠：诱导浓度为4%（v/v），维持浓度为1.5%至2.0%（v/v）。通过尾部或足趾夹捏反应确认小鼠已完全麻醉。
   注意： 定期重新夹捏并评估手术过程中胡须抽动情况，以再次确认麻醉深度。
4. 用眼药膏覆盖眼睛以防止干燥。使用耳杆将小鼠固定在立体定位仪上。通过直肠探针调节的加热垫维持小鼠体温在37 °C。
5. 用动物专用电推剪剃除约5 mm × 12 mm区域的毛发。先涂抹贝塔碘，再用70%（v/v）异丙醇处理。使用手术刀片切开并去除颅骨表面的皮肤。用手术刀片刮除颅骨表面的骨膜。暴露并清洁颅骨表面，操作方法同立体定位手术所述。
6. 将空的玻璃移液管降至前囟，记录前后（A/P）和内侧-外侧（M/L）坐标。参照小鼠脑图谱，计算注射位点的位置。将移液管移至目标位点，并在颅骨上标记，以备后续开窗使用。
   注意： 注射位点和观察窗的位置取决于所研究的脑区以及神经递质或肽类释放投射在皮层中的分布。例如，在最近的一项研究中，采用立体定位坐标 +1.0 至 +2.0 mm A/P 和 +1.0 至 +2.0 mm M/L 将 CNiFER 细胞注射至额叶皮层以进行研究 体内 经典条件反射过程中多巴胺释放的成像
7. 制作一个2 mm × 3 mm的薄颅窗。
   注意： 窗口处的骨片厚度应为15–20 μm。当颅骨表面湿润时，骨片中的小白点应不可见，表明骨片已充分磨薄。
8. 在准备注射细胞时，将浸有人工脑脊液（ACSF）的海绵置于窗口以保持湿润。
9. 收获在T75培养瓶中生长至约80%汇合度的CNiFER克隆。吸除培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。注意：这些步骤中省略胰蛋白酶处理。
10. 移除 PBS，加入 10 ml ACSF 以使细胞从培养瓶底部脱落。吹打混悬细胞以分散细胞团块。离心后将沉淀重悬于 100 μl ACSF 中。以 1,400 x g 离心 30 秒，吸除上清液，保留覆盖有 ACSF 的沉淀。此步骤使细胞团块保持悬浮状态。
11. 用矿物油回填第1.2步制备的注射移液管，将移液管装入纳米注射仪，推进活塞以排出少量油滴。取5 μl CNiFER细胞悬液滴加到靠近小鼠制备区域的塑料石蜡膜条上。用拉制好的移液管吸取CNiFER细胞或对照CNiFER细胞。
12. 将移液器移动至目标 X 和 Y 坐标， 即，前后方向（A/P）和内外侧方向（M/L）参照步骤1.5中的标注。将移液管下降，穿透变薄的颅骨，并继续下降至颅骨表面下约200–400 μm处，将CNiFER细胞注入大脑皮层第2/3层。
13. 使用纳米注射器在最深位点注射约 4.6 nl 的 CNiFER 细胞，观察油相与细胞界面的移动，随后等待 5 分钟，使细胞充分释放。将移液管回撤约 100 μm，再次注射约 4.6 nl 的 CNiFER 细胞，静置 5 分钟. 然后缓慢轻柔地抽出移液管，以防止CNiFERs回流。在一处或多处相邻位点重复注射。
14. 重复步骤1.8-1.12，使用对照HEK293细胞（即，缺乏G蛋白偶联受体[GPCR]的HEK293/TN-XXL/Gqi5克隆。将CNiFER细胞与对照细胞的注射位点间隔约200 μm。
15. 完成细胞移植后，用ACSF冲洗减薄的颅窗，并等待颅骨干燥。滴加一滴氰基丙烯酸酯胶（参见 材料) 上，迅速将预先切割好的无菌盖玻片置于胶上。轻轻按压盖玻片使其紧贴颅骨数秒钟。静置让胶水干燥 2 分钟。
16. 用牙科水泥密封盖玻片边缘，并在窗口周围形成一个储水井，以容纳浸没物镜所需的液体。
17. 成像过程中为固定小鼠头部，将定制的头杆用少量氰基丙烯酸酯胶水粘附于窗口后方。待胶水完全干燥后，再添加额外的牙科水泥以进一步加固定制头杆。
18. 除窗口区域外，用一层牙科水泥覆盖颅骨其余表面。确保皮肤边缘被水泥覆盖，并静置干燥20分钟。
19. 手术结束后，停止异氟烷给药，将小鼠置于笼内加热垫上，直至其从麻醉中完全恢复。皮下注射含5%（w/v）葡萄糖的生理盐水以补充水分，腹腔注射0.05至0.1 mg/kg布托啡诺（速释型）用于术后镇痛。
    注意： 为尽量减少小鼠对人源CNiFERs可能产生的免疫反应，自CNiFERs注射前一日开始，每日腹腔注射环孢素20 μl/100 g。
20. 将小鼠放回其饲养笼中，提供食物和水。

2. 体内 成像 CNiFER 克隆

注意： 使用双光子显微镜和头部固定装置对小鼠进行活体成像。成像过程中无需麻醉。在清醒状态下对动物进行成像时，每次头部固定时间应限制在数小时内，以降低应激水平。成像间歇期间，将动物放回其饲养笼中以提供食物和饮水。通过调暗室内灯光并将小鼠部分身体置于围栏中，可进一步减少潜在的应激反应。

1. 术后次日，将小鼠固定于成像平台，通过将颅骨上植入的金属头杆旋紧至头部固定架上。
   注意：在对清醒小鼠进行成像时，由于头部固定装置可能引起应激反应，成像时间不应超过数小时。
2. 将带有头部固定小鼠的成像平台置于配备10X（0.30 NA）和40X（0.80 NA）水浸物镜的双光子成像显微镜中。
3. 插入用于荧光共振能量转移（FRET）成像（增强型青色荧光蛋白 [eCFP] 和 Citrine）的滤光片组，该滤光片组配备505 nm的二向色镜，以及用于检测eCFP的460 nm至500 nm带通滤光片和用于检测Citrine的520 nm至560 nm带通滤光片。
4. 将ACSF加入含有去颅骨窗的孔中，并将水浸物镜浸入ACSF中。使用目镜配合汞灯及绿色荧光蛋白（GFP）滤光立方体，定位颅窗下方的皮层表面及血管结构。
   注意： 血管的分布模式有助于在多次成像过程中定位并重复观察同一区域。 切换至40倍水浸物镜，使用GFP滤光片组和汞灯，通过手动聚焦于细胞上方的皮层表面来定位CNiFERs。
5. 双光子成像设置。选择适用于双光子成像的光路。对于典型的商用系统，使用软件切换至双光子成像模式，并将光信号引导至非扫描型探测器中的光电倍增管（PMT）。打开近红外飞秒脉冲激光器，选择波长为820 nm，功率设置为5–15%。
   注意： 5% 的功率通常可在样本处提供约 25 mW 的输出。
6. 设置 PMT1 & PMT2 电压接近最大值，通常为 700–1,000 V，具体取决于 PMT 型号。将每个通道的增益设置为 1 并将物镜的 z 轴位置归零。
7. 将物镜从皮层表面下移约100至200 μm，开始进行x-y扫描。针对每个通道调节激光功率、增益和PMT电压。 即，eCFP 和 Citrine，以优化 CNiFER 荧光的信噪比。
8. 使用软件中的缩放功能，将图像限定在包含 CNiFER 细胞及背景区域的范围内。扫描速率不应低于每 2 秒一帧（0.5 Hz），像素驻留时间为 4 μs。调整线平均次数以获得适当的信噪比。 例如，卡尔曼双线平均法。
9. 在CNiFER细胞周围绘制感兴趣区域（ROI），每个层面包含约3至4个细胞。设置对ROI平均荧光强度的实时分析。开始采集以随时间监测CNiFER荧光信号。
10. 在实验操作前后收集CNiFERs的荧光信号， 例如，电刺激，通道视紫红质-2（ChR2）刺激，行为，由用户确定。
11. 成像实验完成后，将小鼠放回其原居住笼具中。根据需要，可在不同时间点重复进行成像。当重新对细胞成像时，参考先前获取的低倍率血管图像，以重新定位至相同的成像区域（步骤 2.4）。
    注意： 植入式CNiFERs可成像至少7天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氰基丙烯酸酯胶水	Loctite	Loctite no. 495	手术与立体定位注射
塑料石蜡膜	VWR	Parafilm®	手术与立体定位注射
NANOINJECTOR	Drummond	3-000-204	手术与立体定位注射
玻璃电极	Drummond	3-000-203G	手术与立体定位注射
手持式钻机	OSADA	Exl-M40	手术与立体定位注射
钻头磨头	Fine Scientific	19007-05; 19007-07	手术与立体定位注射
灭菌浴	FST	18000-45, Hot Bead Sterilizer	手术与立体定位注射
异氟烷麻醉舱/面罩	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm	手术与立体定位注射
带臂三维显微镜	Zeiss		手术与立体定位注射
光纤光源			手术与立体定位注射
聚维酮碘（Betadine）			手术与立体定位注射
70 % (v/v) 异丙醇			手术与立体定位注射
聚维酮碘消毒垫	dynarex	1108	手术与立体定位注射
0.9% 氯化钠注射液（INJECTION, USP, 918610）			手术与立体定位注射
环孢素注射液（CYCLOSPORINE, INJECTION, USP）			手术与立体定位注射
Buprenex（注射用）丁丙诺啡（每克啮齿类动物 0.03 μg）	Sigma		手术与立体定位注射
眼用软膏	Akorn	NDC 17478-235-35	手术与立体定位注射
Surgifoam	Ethicon		手术与立体定位注射
Grip 牙科水泥	Dentsply	#675571, 675572	手术与立体定位注射
Instant SuperGlue	NDindustries		手术与立体定位注射
LOCTITE 4041			手术与立体定位注射
METABOND	C&B		手术与立体定位注射
0 号盖玻片	Fisher		手术与立体定位注射
立体定位仪框架	Kopf		手术与立体定位注射
直肠探头与加热垫	FHC	40-90-8D, DC Temperature Controller, 40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad, 40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe	手术与立体定位注射
用于成像的光学面包板	Thorlabs		手术与立体定位注射
矿物油	Fisher	S55667	手术与立体定位注射
Kwik-Cast（硅胶弹性体）	World Precision Instruments		手术与立体定位注射
缝合线	Ethicon	18’’, 1667, 4-0	手术与立体定位注射
剪刀	Fine Scientific Tools	91500-09, 15018-10	手术与立体定位注射
镊子	Fine Scientific Tools	11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10	手术与立体定位注射
学生用 Halsted-Mosquito 止血钳	Fine Scientific Tools	91308-12	手术与立体定位注射
小血管电凝器套件	Fine Scientific Tools	18000-00	手术与立体定位注射
热珠灭菌器	Fine Scientific Tools	18000-45	手术与立体定位注射
带硅胶垫的器械盒	Fine Scientific Tools	20311-21	手术与立体定位注射
带硅胶垫的塑料灭菌容器	Fine Scientific Tools	20810-01	手术与立体定位注射
用于活体成像的双光子固定式显微镜	Olympus	FV1200 MPE	活体成像
多光子激光器	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	活体成像
绿色激光器	Olympus	473 nm Laser	活体成像
xy 平移底座	Scientifica	MMBP	活体成像
用于 YFP 和 CFP 的 FRET 滤光片组	Olympus		活体成像
25倍水浸物镜	Olympus		活体成像
气浮光学平台	Newport		活体成像
定制的避光屏蔽笼	Thorlab		活体成像