使用基于细胞的神经递质荧光工程报告基因对神经递质释放进行成像

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1. CNiFER 植入小鼠皮层

1. 手术前在高压灭菌器中对所有手术工具进行消毒。用 70% 乙醇擦拭并铺上干净的实验室尿布，为手术准备一个半无菌区域。
2. 通过在垂直电极拉拔器上拉动玻璃毛细管（内径0.53mm）来制备CNiFER注射移液器。使用一对 5 号细尖镊子将电极尖端折断至直径为 ~40 μm.
   注意：这最好在带有经纬网的立体变焦显微镜下完成。
3. 用异氟醚麻醉成年（出生后第60-90天）C57BL / 6小鼠：4%（v / v）用于诱导，1.5%至2.0%（v / v）用于维持。使用尾部或脚趾捏住以确保鼠标完全麻醉。
   注意：在整个手术过程中定期重新捏住并评估胡须抽搐，以重新评估麻醉深度。
用
4. 眼药膏遮住眼睛，防止干燥。将鼠标安装在带有耳杆的立体定位框架中。使用由直肠探头调节的加热垫将小鼠体温保持在37°C。
5. 用动物电动剃须刀剃须约 5 毫米 x 12 毫米的区域。涂抹甜菜碱，然后涂抹 70% （v/v） 异丙醇。使用手术刀刀片切割并去除颅骨表面的皮肤。使用手术刀刀片从颅骨表面去除骨膜。暴露并清洁颅骨表面，如立体定位手术所述。
将
6. 空玻璃移液器降低到前后 （A/P） 和中外侧 （M/L） 坐标。参考小鼠脑图谱，计算注射部位的位置。将移液器移至目标部位并标记颅骨以进行后续窗口形成。
   注意：注射部位和窗口取决于要研究的区域以及皮层中神经递质或肽释放突起的分布。例如，在最近的一篇出版物中，立体定位坐标 +1.0 至 +2.0 mm A/P 和 +1.0 至 +2.0 mm M/L 用于将 CNiFER 细胞注射到额叶皮层中，以对经典条件反射期间的多巴胺释放进行体内成像。
7. 形成一个 2 mm x 3 mm 的薄颅窗。
   注意：窗口中的骨头应为 15-20 μm 厚。如果骨头足够薄，当头骨表面湿润时，骨头中的小白点应该不可见。
将
8. 人工脑脊液 （ACSF） 浸泡过的海绵放在窗户上，以保持湿润，同时准备注射细胞。
9. 收获在 T75 烧瓶中生长的 CNiFER 克隆，达到 ~80% 汇合度。吸出培养基并用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞。注意：这些步骤省略了胰蛋白酶。
10. 取出PBS并使用10ml ACSF从烧瓶底部去除细胞。研磨细胞以解离细胞团块。离心并将沉淀重悬于 100 μl ACSF 中。以 1,400 x g 离心 30 秒，除去上清液，留下覆盖有 ACSF 的沉淀。此步骤会留下一团悬浮细胞。
用
11. 矿物油回装步骤1.2中制备的注射移液器，将移液器加载到纳米注射器上，并推进柱塞以喷出一小滴油珠。将 5 μl CNiFER 细胞悬液放在小鼠制剂附近的一条塑料石蜡薄膜上。将CNiFER或对照CNiFER细胞拉入拉出的移液器中。
12. 将移液器移动到目标 X 和 Y 坐标，即步骤 1.5 中记下的 A/P 和 M/L。降低移液器，刺穿变薄的头骨，并继续在颅骨表面以下~200-400μm处，将CNiFER细胞沉积在皮质的2/3层中。
13. 用纳米注射器在最深的部位注射~4.6 nl的CNiFER细胞，注意油和细胞界面的运动，然后等待5分钟让细胞分配。取出移液器~100μm，再注入~4.6 nl的CNiFER细胞，等待5分钟。然后缓慢而轻柔地取出移液器，以防止CNiFER回流。在一个或多个相邻部位重复注射。
14. 用对照HEK293细胞（即缺乏G蛋白偶联受体[GPCR]的HEK293 / TN-XXL / Gqi5克隆）重复注射步骤1.8-1.12。将CNiFER和对照细胞注射位点分开~200μm。
15. 完成细胞植入后，用ACSF冲洗变薄的颅骨窗口，等待颅骨干燥。在窗户上滴一滴氰基丙烯酸酯胶水（参见材料），然后快速将预先切割的无菌盖玻璃放在胶水的顶部。轻轻地将盖板玻璃推到头骨上几秒钟。让胶水干燥 2 分钟。
16. 用牙科粘固剂密封盖板玻璃的边缘，并在窗户周围形成一个井，以容纳浸渍物镜的水。
17. 为了在成像过程中固定鼠标的头部，请在窗后安装一个带有一小滴氰基丙烯酸酯胶水的定制头杆。让胶水彻底干燥，然后添加额外的牙科粘固剂以进一步加固定制的头杆。
用
18. 一层牙科水泥覆盖颅骨表面的其余部分，除窗户外。确保皮肤边缘被水泥覆盖，让它干燥 20 分钟。
19. 手术后，停止异氟醚给药，并将鼠标放在笼子中的加热垫上，直到它从麻醉中完全恢复。在盐水中注射5%（w / v）葡萄糖（皮下[s.c.]）进行补液，注射0.05至0.1mg / kg丁丙诺啡（腹腔内[ip]，速溶）用于术后镇痛。
    注意：为了尽量减少对人CNiFER的潜在免疫反应，从注射CNiFER的前一天开始，每天向小鼠注射20μl / 100g环孢素（ip）。
20. 将鼠标放回其家笼中以获取食物和水。

2. CNiFER克隆的体内成像

：使用双光子显微镜和头部固定装置对小鼠进行实时成像。成像期间不需要麻醉。在清醒状态下对动物进行成像时，将头枕限制在一次仅几个小时，以减轻压力水平。将动物放回家中 笼子 在成像之间获取食物和水。通过使室内灯光和外壳中鼠标的周围部分变暗，可以最大限度地减少潜在压力。

1. 在手术后的第二天，通过将植入颅骨上的金属头杆拧到头部固定框架上，将鼠标安装在成像平台上。
   注意：在对清醒小鼠进行成像时，由于头枕装置引起的潜在压力，成像时间不应超过几个小时。
将
2. 带有头部约束小鼠的成像平台放入配备 10X （0.30 NA） 和 40X （0.80 NA） 水浸物镜的双光子成像显微镜中。
3. 插入用于荧光共振能量转移 （FRET） 成像的滤光片立方体（增强型青色荧光蛋白 [eCFP] 和黄水晶），该滤光片具有 505 nm 的二向色镜和跨越 460 nm 至 500 nm 的带通滤光片，用于测量 eCFP，520 nm 至 560 nm 用于测量黄水晶。
将
4. ACSF 添加到包含薄头骨窗口的孔中，并将水浸物镜降低到 ACSF 中。将目镜与汞灯和绿色荧光蛋白 （GFP） 滤光片立方体结合使用，以定位窗口下方的皮层和脉管系统的表面。
   注意：脉管系统的模式有助于在重复的成像日中定位和成像同一区域。 切换到 40 倍水浸物镜，通过使用 GFP 滤光片立方体和汞灯手动聚焦在细胞上方的皮层表面来定位 CNiFER。
设置双
5. 光子成像。为双光子成像选择合适的光路。对于典型的商业系统，使用该软件切换到双光子成像模式，并将光线重定向到非去扫描探测器中的光电倍增管 （PMT）。打开近红外飞秒脉冲激光器，选择 820 nm 的波长和 5-15% 的功率设置。
   注意：5% 功率通常在样品处提供 ~25 mW。
6. 将 PMT1 和 PMT2 电压设置为接近最大值，通常为 700-1,000 V，具体取决于 PMT。将每个通道的增益设置为 1，并将物镜的 z 位置归零。
将
7. 物镜从皮质表面降低~100至200μm，然后开始xy扫描。调整每个通道（即eCFP和黄水晶）的激光功率，增益和PMT电压，以优化CNiFER荧光的信噪比。
8. 使用软件中的缩放功能将图像限制在包含 CNiFER 单元格和背景区域的区域。使用不低于每 2 秒 （0.5 Hz） 一帧的扫描速率，每像素 4 μs。调整线平均以获得合适的信噪比，例如卡尔曼 2 线平均。
在
9. CNiFER单元周围绘制感兴趣区域（ROI），每个平面围绕大约3到4个单元。设置对 ROI 平均强度的实时分析。开始采集以监测CNiFER荧光随时间的变化。
在
10. 实验作之前和期间收集 CNiFER 的荧光，例如，电刺激、通道视紫红质 2 （ChR2） 刺激、行为，由用户确定。
11. 成像实验完成后，将鼠标放回其家庭笼子。根据需要，跨天重复成像。重新成像时，细胞参考先前获取的低放大倍率脉管系统图像以定向回相同的成像区域（步骤2.4）。
    注意：植入的CNiFER可以成像至少7天。