成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

摘要

来源：Doser, R., 等. 体内神经元钙处理的亚细胞成像. J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了对转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）品系腹神经索神经元中亚细胞钙离子流的活体成像。实验采用了两种不同的钙离子指示剂：一种品系使用细胞质指示剂，另一种品系使用线粒体指示剂。通过荧光显微镜观察神经元，实时监测神经元细胞质和线粒体内荧光强度的变化，从而反映神经元自发活动过程中的钙离子流动情况。

方案

1. 成像用线虫的制备

1. 制备琼脂垫
   1. 在13 mm × 100 mm玻璃培养管中，将分子级琼脂溶解于M9培养基中，配制3 mL 10%琼脂溶液，并微波加热数秒。
      注意：熔融琼脂可在加热块上保存最多1小时，或在每次需要制备琼脂垫时新鲜配制。
   2. 将一块显微镜载玻片置于另外两块各带有两层实验室胶带的载玻片之间（见图1A-i）。
   3. 剪去1,000 μL移液器吸头（无滤芯）的尖端，用其吸取少量琼脂液滴至中心盖玻片的中央（图1A-i）。
   4. 用另一块载玻片压在琼脂液滴上，将其压平（图1A-ii）。
   5. 待琼脂冷却后，用13 mm × 100 mm玻璃培养管的开口边缘切割琼脂，形成小圆片（图1A-iii），然后去除周围多余的琼脂。
2. 制备线虫滚动溶液
   1. 将蝇蕈醇粉末溶于M9培养基中，配制成30 mM储备液。分装为50 μL等份，4 °C保存。
   2. 每3–5天解冻一份新的30 mM蝇蕈醇溶液（使用期间存放于20 °C）。
   3. 将30 mM蝇蕈醇储备液与聚苯乙烯微珠按1:1比例稀释，配制成滚动溶液。
3. 定位线虫以进行成像
   1. 在琼脂垫中央加入1.6 μL滚动溶液。
      注意：液体用量应根据成像对象的年龄调整（幼龄线虫用量较少，老龄线虫用量较多）。
   2. 使用合适的线虫挑取工具（如玻璃或铂丝挑针），将无多阴突表型、所需年龄的线虫转移至琼脂垫上的滚动溶液中（图1A-iv）。注意：代表性数据来自1日龄雌雄同体线虫（GCaMP6f品系 = FJH185；mitoGCaMP品系 = FJH597），可通过仅存在单列卵来识别。
   3. 等待约5分钟，使蝇蕈醇降低线虫活动性，随后在琼脂垫上加盖22 mm × 22 mm盖玻片，物理限制线虫移动。
   4. 为成像腹侧神经索中的神经突，通过轻轻滑动盖玻片，将线虫调整至图1B和图1C所示的方向。
      注意：为观察腹侧神经索，应将线虫头部朝上放置，并滚动线虫，使肠位于近端部分的右侧、远端部分的左侧（从观察者视角）。若需成像背侧神经索，则采用相反方向（图1C）。
4. 将线虫安装至显微镜
   1. 在将样品装入显微镜载物台前，先在盖玻片上滴加一滴浸油。
   2. 使用低倍物镜（10×）在明场下找到线虫。
   3. 切换至100×物镜并调节焦距。
   4. 使用488 nm成像激光激发GCaMP或mitoGCaMP荧光，定位AVA神经突。
      注意：调节时应使用微小调整，避免压碎线虫或移开盖玻片。

2. 高分辨率图像流的获取

1. 体内 GCaMP 成像
   1. 将曝光时间设置为 20 ms。
   2. 调整成像激光器和采集参数，使基础 GCaMP 荧光信号位于相机动态范围的中值区域。有关使用其他显微镜系统优化成像参数的建议，请参见讨论部分。​
      注意： 对于本研究所使用的光学系统，将 488 nm 成像激光器设置为以下输出参数：激光功率 = 50%，衰减 = 1。将其他采集参数调整如下：EM（电子倍增）增益 = 200，前置放大器增益 = 1。
   3. 在使用 GCaMP 荧光以 100 倍放大倍率定位 AVA 神经纤维后，将 Z 轴漂移校正器（ZDC，见材料表）设置为 ±30 μm 范围，并启动连续自动对焦。在成像前根据需要手动校正焦平面。
   4. 以 100 倍放大倍率采集图像序列。本研究所用系统可实现长达 10 分钟的连续成像。
2. 体内 mitoGCaMP 成像
   1. 根据需要执行步骤 2.1.1–2.1.2，以获得处于相机动态范围中值区域的基础 mitoGCaMP 荧光信号。
      注意。 对于本研究所使用的光学系统，将 488 nm 成像激光器设置为以下输出参数：激光功率 = 20%，衰减 = 10。将采集参数调整如下：EM 增益 = 100，前置放大器增益 = 2。
   2. 在使用 mitoGCaMP 荧光定位 AVA 神经纤维中的线粒体后，按照步骤 2.3 所述设置 ZDC。
   3. 以 100 倍放大倍率采集图像序列。

结果

图1：固定与滚动 秀丽隐杆线虫 用于腹神经索的成像。 (A制备琼脂垫并将单个线虫挑入滚动溶液的步骤示意图。B) 线虫在成像前需要重新定位的一个示例。红色箭头指示线虫需要向右翻转，可通过将...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x/1.40 油镜	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 物镜	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm 盖玻片	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
CleanBench 实验台	TMC		带振动控制
滤光轮或滑块	ASI		适用于直径 25 mm 滤光片
FJH 185	秀丽隐杆线虫遗传中心	FJH 185	线虫品系
FJH 597	秀丽隐杆线虫遗传中心	FJH 597	线虫品系
GFP 带通发射滤光片	Chroma		525 ± 50 nm（直径 25 mm）
ILE 激光合束器	Andor Technologies		4 激光线
ILE 固态 488 nm 激光器	Andor Technologies		50 mW
IX83 转盘共聚焦显微镜	Olympus		配备 Yokogawa CSU-X1 转盘
iXon Ultra EMCCD 相机	Andor Technologies
低自发荧光浸油	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		版本 7.10.1
显微镜控制盒	Olympus		IX3-CBH
蝇蕈醇（Muscimol）	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Polybead 微球	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
稳定培养箱	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	设定为 15 °C
载物台控制器	ASI		带滤光轮控制
标准显微镜载玻片	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
触摸面板控制器	Olympus		I3-TPC
Z 轴漂移校正器	Olympus		IX3-ZDC2