成像秀丽隐杆线虫神经元中的亚细胞钙动力学

摘要

来源：Doser, R., 等. 体内神经元钙处理的亚细胞成像. J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了对转基因秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）品系腹神经索神经元中亚细胞钙离子流的活体成像。实验采用了两种不同的钙离子指示剂：一种品系使用细胞质指示剂，另一种品系使用线粒体指示剂。通过荧光显微镜观察神经元，实时监测神经元细胞质和线粒体内荧光强度的变化，从而反映神经元自发活动过程中的钙离子流动情况。

方案

1. 成像用线虫的制备

1. 制备琼脂垫
   1. 在13 mm × 100 mm玻璃培养管中，将分子级琼脂溶解于M9培养基中，配制3 mL 10%琼脂溶液，并微波加热数秒。
      注意：熔融琼脂可在加热块上保存最多1小时，或在每次需要制备琼脂垫时新鲜配制。
   2. 将一块显微镜载玻片置于另外两块各带有两层实验室胶带的载玻片之间（见图1A-i）。
   3. 剪去1,000 μL移液器吸头（无滤芯）的尖端，用其吸取少量琼脂液滴至中心盖玻片的中央（图1A-i）。
   4. 用另一块载玻片压在琼脂液滴上，将其压平（图1A-ii）。
   5. 待琼脂冷却后，用13 mm × 100 mm玻璃培养管的开口边缘切割琼脂，形成小圆片（图1A-iii），然后去除周围多余的琼脂。
2. 制备线虫滚动溶液
   1. 将蝇蕈醇粉末溶于M9培养基中，配制成30 mM储备液。分装为50 μL等份，4 °C保存。
   2. 每3–5天解冻一份新的30 mM蝇蕈醇溶液（使用期间存放于20 °C）。
   3. 将30 mM蝇蕈醇储备液与聚苯乙烯微珠按1:1比例稀释，配制成滚动溶液....

结果

图1：固定与滚动 秀丽隐杆线虫 用于腹神经索的成像。 (A制备琼脂垫并将单个线虫挑入滚动溶液的步骤示意图。B) 线虫在成像前需要重新定位的一个示例。红色箭头指示线虫需要向右翻转，可通过将.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x/1.40 油镜	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 物镜	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm 盖玻片	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
CleanBench 实验台	TMC		带振动控制
滤光轮或滑块	ASI		适用于直径 25 mm 滤光片
FJH 185	秀丽隐杆线虫遗传中心	FJH 185	线虫品系
FJH 597	秀丽隐杆线虫遗传中心	FJH 597	线虫品系
GFP 带通发射滤光片	Chroma		525 ± 50 nm（直径 25 mm）
ILE 激光合束器	Andor Technologies		4 激光线
ILE 固态 488 nm 激光器	Andor Technologies		50 mW
IX83 转盘共聚焦显微镜	Olympus		配备 Yokogawa CSU-X1 转盘
iXon Ultra EMCCD 相机	Andor Technologies
低自发荧光浸油	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		版本 7.10.1
显微镜控制盒	Olympus		IX3-CBH
蝇蕈醇（Muscimol）	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
Polybead 微球	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
稳定培养箱	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	设定为 15 °C
载物台控制器	ASI		带滤光轮控制
标准显微镜载玻片	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
触摸面板控制器	Olympus		I3-TPC
Z 轴漂移校正器	Olympus		IX3-ZDC2