使用共聚焦显微镜成像定量树突棘

摘要

来源：Gouder, 等. 来自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘的三维定量分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用共聚焦显微镜对经转导并免疫标记的锥体神经元中的树突棘进行成像与分析。通过估算树突的直径和长度来减少背景噪声并追踪树突。自动化的树突棘分割包括设定树突和树突棘尺寸参数并对树突棘进行分类。生成三维模型并导出用于进一步分析。

方案

1. 神经元培养

1. 将6孔培养板中的玻璃盖玻片用多聚鸟氨酸处理（用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）按1/6比例稀释，储存浓度为0.01%），4℃孵育过夜（O/N），随后用DPBS洗涤3次。然后，在生物安全柜中加入层粘连蛋白（储存浓度为1 mg/ml，用DPBS稀释500倍），孵育至少10小时。
2. 以低密度（50,000 个细胞/cm²）将神经干细胞（NSC）接种于含玻璃盖玻片的6孔培养板中，每孔加入3 ml培养基，培养基成分为：杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12，500 ml）、2瓶N2添加剂（每瓶5 ml）、2瓶B27添加剂（每瓶10 ml）、10 ml青霉素-链霉素溶液（青霉素=10,000 单位/ml，链霉素=10,000 单位/ml）、1 ml 2-巯基乙醇（储存液：50 mM）以及层粘连蛋白（1/500），不添加生长因子。
   关键步骤：添加细胞时需缓慢旋转加样，操作务必轻柔，以减少细胞聚集。
3. 移除原有培养基，加入含有新鲜层粘连蛋白溶液（2 µg/ml）的新鲜N2B27培养基，以维持神经元在玻璃盖玻片上的贴附状态并防止细胞成团。每3天更换一次培养基。在更换新鲜培养基前，保留部分原有培养基（200 µl），以防细胞干燥。或者，也可快速操作并更换全部培养基体积（3 ml）。

2. 慢病毒转导

注意：绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）的表达由小鼠磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase, PGK）启动子驱动。本研究中，病毒滴度为 400 ng/µl（以 1× 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）配制的储存液）。

1. 在人诱导性多能干细胞或iPSC分化而来的神经元成熟的任意阶段，通过添加病毒颗粒进行转导：每孔（6孔板）加入1 µl含有40 ng GFP慢病毒载体的储存液，并在新鲜培养基中孵育48小时。注意：本方案中，该孵育时长可实现树突棘结构的良好标记。

3. 免疫荧光

注意： 为了改善对整个脊柱形态的标记，在通透条件下使用抗GFP抗体进行了免疫荧光标记。

1. 移除培养基，将转导后的盖玻片细胞在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟，然后用1×PBS洗涤3次（每次10分钟）。
2. 将盖玻片浸入含有0.05% Triton（100倍稀释）和10%马血清的PBS中，室温孵育1小时，然后用1×PBS洗涤3次。
3. 在每个盖玻片上加入100 µl含4%马血清和抗GFP一抗（1/1,000稀释）的1×PBS溶液，于4°C避光孵育过夜，随后用1×PBS洗涤3次。
4. 将Alexa Fluor 488标记的二抗（1/200稀释）加入含0.5% Tween 20的PBS中，室温孵育1小时，然后用1×PBS洗涤3次，最后用荧光显微镜封片剂将盖玻片封于载玻片上。

4. 树突棘成像

1. 通过共聚焦激光扫描显微镜进行共聚焦成像。
2. 选择具有锥体形态且树突完全分支的健康神经元，并从独立实验中每种条件下至少定量分析10个神经元。每根树突定量分析60 - 100 µm长度。
3. 使用40倍油镜（NA = 1.3）和488 nm激光线激发GFP，样品处的典型峰值功率约为20 µW。将像素大小设为约80 nm，以充分采样树突棘。
   注意：后续分析需要图像中的噪声不会影响树突和树突棘的准确分割。根据上述空间采样和功率设置，我们观察到3.15 µs的像素驻留时间足以收集足够的光子来构建此类图像。对于荧光较弱的样品，可通过平均2至4次扫描来提高图像质量。可能需要获取多个XY图像区域以覆盖目标区域，之后必须在处理前将这些图像拼接在一起。
4. 为采样整个神经元体积，采集Z轴间距为150 nm至300 nm的Z栈图像，获得20至30个Z切片。
   注意：采用这些设置实现的横向空间分辨率为234 nm，轴向分辨率为591 nm。此处选择的采样参数是合适的，但由于轴向分辨率大于待成像树突棘的最小尺寸，分析更倾向于检测从树突侧向延伸的树突棘。

5. 树突棘的三维定量分析

注意： 以下部分专门描述使用 Imaris 软件进行分析的方法。其他可选方案包括 NeuronStudio 或 Metamorph，这些软件也可提供类似结果。

使用以下关键设置：

1. 作为预处理步骤，通过软件提供的图像处理功能使用高斯滤波。通过图像处理 > 平滑 > 高斯滤波执行高斯滤波操作。将滤波器宽度设置为等于 XY 平面上的像素尺寸。
2. 使用软件的 Filament Tracer 模块对树突进行半自动追踪。
   1. 首先，使用软件 Slice 选项卡中的距离工具估算树突直径。
   2. 在 Surpass 选项卡中，点击 Filaments 工具。为提高鲁棒性，本方案采用半自动追踪方式；点击跳过自动创建。此时模块界面将显示 Draw 选项卡。在此选择 AutoPath 作为方法，Dendrite 作为类型，并输入估算的树突直径。
   3. 使用指针的选择模式，使光标变为方框。按住 Shift 键并右击树突起点。注意：软件将执行初始计算。
   4. 沿树突移动指针。从起点（以蓝色球体表示）开始，将显示一条黄色线条，代表最可能的树突路径。按住 Shift 键并左击树突终点。
3. 执行自动棘突分割。注意：模块界面将自动识别已追踪树突上的棘突。
   1. 在模块界面中，点击 Creation 选项卡。在 Rebuild 下拉列表中选择重建树突直径，并勾选保留数据复选框。然后点击重建按钮。
   2. 设置阈值，使分割出的体积与实际树突体积相符。算法选择“距离图中的最短距离”。点击下一步按钮。
   3. 再次使用软件 Slice 选项卡中的距离工具确定最小棘突头直径和最大长度，然后返回 Surpass 选项卡并输入参数。对于本方案，最小直径约为 200–300 nm，最大长度为 4 µm，可作为良好的起始值。不要勾选允许分支棘突选项。点击下一步按钮。
   4. 调整种子点阈值，使代表棘突的蓝色点准确位于实际棘突头上。点击下一步按钮。注意：核心计算现在开始，可能耗时较长。
4. 前往模块界面的 Tools 选项卡对棘突进行分类。点击分类棘突。在弹出的用户界面中，确保存在四个基于形态学定义的类别：短粗型（Stubby）：长度 <1 µm；蘑菇型（Mushroom）：棘突长度 >3 且头部最大宽度 > 颈部平均宽度 × 2；细长型（Long thin）：头部平均宽度 ≥ 颈部平均宽度；类丝状伪足型（Filopodia-like）：长度 ≤ 4 µm（无头部）。注意：模块界面将生成四个新的 Filament 对象，包含分类结果。
5. 导出统计数据显示：在任一这四个对象界面中，进入 Statistics 选项卡。点击导出所有统计数据到文件按钮。
   注意：还可导出其他统计值，包括树突参数（如长度、面积、平均直径、分支深度、分支角度、体积等）和棘突参数（如直度、附着面积、棘突各部分的长度和体积、棘突直径、密度等）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含钙、镁和酚红的 PD-PBS (1X)	Gibco/ Life Technologies	14190169
多聚-L-鸟氨酸溶液生物试剂	Sigma Aldrich	P4957
小鼠层粘连蛋白	Dutscher Dominique	354232
N2 添加剂	Gibco/ Life Technologies	17502048
不含维生素A的B-27添加剂 (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
含谷氨酰胺-I的DMEM/营养混合物F-12	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal 无血清培养基	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-巯基乙醇	Gibco/ Life Technologies	31350-010
青霉素-链霉素	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP 兔多克隆抗体	Gibco/ Life Technologies	A-6455
马血清	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体	Gibco/ Life Technologies	A11034
多克隆抗-betaIII微管蛋白抗体	Millipore	AB9354
13 mm 盖玻片	VWR	631-0150
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra，粘稠液体	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
人成纤维细胞	Coriell 细胞库	GM 4603 和 GM 1869	美国新泽西州卡姆登，Coriell 医学研究所
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss（德国）	LSM 700
Imaris 软件	Bitplane AG, 苏黎世	6.4.0 版本	需使用 Filament Tracer 和 Imaris XT 模块
Huygens 软件	Huygens software, SVI, 荷兰	Pro 版本	可选（用于去卷积测试）