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1. 神经元培养
用
- 聚鸟氨酸（在 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中稀释至 1/6，原液浓度 0.01%）过夜 （O/N） 处理带有玻璃盖玻片的 6 孔培养板，然后在 DPBS 中洗涤 3 次。然后，在流罩下加入层粘连蛋白（原液浓度1mg / ml，在DPBS中稀释500倍）至少10小时。
将- 低密度（50,000个细胞/ cm 2）的神经干细胞（NSC）铺板和发送在6孔培养板中，带有玻璃盖玻片，在3ml培养基中，培养基由Dulbecco的改良Eagle 培养基/营养混合物F-12或DMEM / F12（500ml）组成，2瓶（每个5 ml）N2补充剂，2小瓶（每个10 ml）B27补充剂， 10 ml Pen-链霉素（青霉素 = 10,000 单位/ml 和链霉素 = 10,000 单位/ml）、1 ml 2-巯基乙醇（储备溶液：50 mM）和层粘连蛋白 （1/500），不含生长因子。
关键步骤：通过添加具有缓慢旋转运动的细胞来小心执行此步骤，以减少细胞聚集。 - 取出培养基。加入含有 2 μg/ml 新鲜层粘连蛋白溶液的新鲜 N2B27 培养基，以保持神经元附着在玻璃盖玻片上并避免结块。每 3 天更换一次培养基。在添加新鲜培养基之前保留一些剩余的培养基（200μl），以防止细胞干燥。或者，快速进行并改变总体积（3 毫升）。
2.慢病毒转导
注：绿色荧光蛋白（GFP）表达由小鼠磷酸甘油酸激酶（PGK）启动子驱动。对于这项研究，病毒滴度为 400 ng/μl（磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 1x 中的储备溶液）。
通过
- 在每个培养孔（6孔板）中加入1μl含有40ngGFP慢病毒载体的储备溶液，在病毒颗粒成熟的任何步骤中转导人诱导多能干细胞或iPSC衍生的神经元，并在新鲜培养基中孵育48小时。注意：对于该协议，孵育的持续时间允许对脊柱结构进行良好的标记。
3.免疫荧光
注：为了改善整个脊柱形态的标记，在透化条件下使用抗GFP抗体进行免疫荧光标记。
- 取出培养基并将转导的细胞固定在盖玻片上，在室温或室温下用 4% 多聚甲醛 10 分钟，然后在 1x PBS 中洗涤 3 次（每次 10 分钟）。
将- 盖玻片浸入补充有0.05%Triton（100x）和10%马血清的PBS中，在室温下1小时，然后在1x PBS中洗涤3次。
- 在每个盖玻片上加入 100 μl 补充有 4% 马血清和一抗 （1/1,000） 的 1x PBS，并稀释 1,000 倍。在 4°C 的暗盒 O/N 中孵育，然后用 1x PBS 洗涤 3 次。
在- 补充有 0.5% 吐温 20 的 PBS 中稀释 Alexa Fluor 488 偶联抗体 （1/200），并在室温下孵育 1 小时。然后，在 1x PBS 中洗涤 3 次，并使用用于荧光显微镜的封片介质将盖玻片安装在载玻片上。
4. 树突状脊柱成像
- 通过共聚焦激光扫描显微镜进行共聚焦成像。
- 选择具有锥体形态和完全树突状树枝的健康神经元，并从单独的实验中量化每种条件至少10个神经元。量化每个树突 60 - 100 μm。
- 使用 40X 油 NA = 1.3 物镜和用于 GFP 激发的 488 nm 激光线采集图像，样品水平下的典型峰值功率约为 20 μW。将像素大小设置为 80 nm 左右，以正确采样树突棘。
注意：后续分析需要噪声不会影响树突和棘正确分割的图像。通过上述空间采样和功率设置，我们观察到3.15 μs的像素停留时间足以收集足够的光子来构建这样的图像。对于暗淡的样品，可以通过平均扫描 2 到 4 次来提高图像质量。可能需要获取多个 XY 图块来覆盖感兴趣区域，然后必须在处理前将其拼接在一起。 - 要对整个神经元体积进行采样，请获取 Z 间距范围为 150 nm 至 300 nm 的 Z 堆栈，产生 20 至 30 个 Z 切片。
注意：使用这些设置实现的横向空间分辨率为 234 nm，轴向分辨率为 591 nm。这里选择的采样是足够的，但由于轴向分辨率大于要成像的棘的最小尺寸，因此分析有利于从树突横向延伸的棘。
5. 3D 树突棘的定量
注意
：以下部分具体描述了如何使用 Imaris 软件进行分析。存在替代实现，包括 NeuronStudio 或 Metamorph，它们可以提供类似的结果。
使用以下关键设置：
- 作为预处理阶段，高斯滤波通过软件提供的图像处理工具使用。通过图像处理>平滑>高斯滤波器执行高斯滤波。将滤镜宽度设置为等于像素大小（以 XY 为单位）。
- 使用软件的 Filament Tracer 模块对枝晶进行半自动追踪。
- 首先，使用软件的"切片"选项卡中的距离工具估计枝晶直径。
- 在"超越"选项卡中，单击"灯丝"工具。为了获得更好的鲁棒性，该协议依赖于半自动跟踪;单击跳过自动创建。模块界面现在显示绘制选项卡。在这里，选择 AutoPath 作为方法，选择 Dendrite 作为类型，并输入估计的枝晶直径。
- 使用指针的"选择"模式，将光标变成一个框。按住 Shift 键右键单击枝晶起点。注意：软件执行初始计算。
- 沿着树突移动指针。从起点（表示为蓝色球体）开始，显示一条黄线，代表最可能的枝晶路径。按住 Shift 键左键单击枝晶端点。
- 执行自动主干分割。注意：跟踪的枝晶上的棘将由模块界面自动找到。
- 在模块界面中，单击"创建"选项卡。在"重建"下拉列表中，选择"重建枝晶直径"，然后选中"保留数据"框。然后单击"重建"。
- 设置阈值，使分段体积对应于实际的枝晶体积。作为算法，从距离图中选择 最短距离（Shortest Distance） 。单击"下一步"按钮。
- 再次使用软件的"切片"选项卡中的距离工具确定最小的脊柱头直径和最大长度，然后返回"超越"选项卡并输入参数。对于该协议，最小直径的值约为 200 - 300 nm，最大长度的值约为 4 μm，是很好的起点。不要选中允许分支主干框。单击"下一步"按钮。
- 调整种子点阈值，使代表刺的蓝色点定位到实际的刺头。单击"下一步"按钮。注意：核心计算现在已完成，可能会很长。
通过- 转到模块界面的"工具"选项卡对主骨进行分类。单击"对主干进行分类"。在提示的用户界面中，确保有四个类别，由其形态定义如下： 短短：长度 <1 μm;蘑菇：长度（脊柱）>3 和最大宽度（头部）>平均宽度（颈部）x 2;长细：平均宽度（头部）≥平均宽度（颈部）;丝状伪足样：长度≤ 4 μm（无头部）。注意：模块接口生成四个包含分类结果的新 Filament 对象。
- 导出统计数据：在这四个对象界面中的任何一个上，转到统计选项卡。单击将所有统计数据导出到文件按钮。
注意：可以导出枝晶（例如，长度、面积、平均直径、分支深度、分支角度、体积等）和棘（例如，直线度、附着面积、不同脊柱部件的长度和体积， 脊柱直径、密度等）。