使用共聚焦显微镜成像定量树突棘

摘要

来源：Gouder, 等. 来自人诱导性多能干细胞的锥体神经元树突棘的三维定量分析。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用共聚焦显微镜对经转导并免疫标记的锥体神经元中的树突棘进行成像与分析。通过估算树突的直径和长度来减少背景噪声并追踪树突。自动化的树突棘分割包括设定树突和树突棘尺寸参数并对树突棘进行分类。生成三维模型并导出用于进一步分析。

方案

1. 神经元培养

1. 将6孔培养板中的玻璃盖玻片用多聚鸟氨酸处理（用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）按1/6比例稀释，储存浓度为0.01%），4℃孵育过夜（O/N），随后用DPBS洗涤3次。然后，在生物安全柜中加入层粘连蛋白（储存浓度为1 mg/ml，用DPBS稀释500倍），孵育至少10小时。
2. 以低密度（50,000 个细胞/cm²）将神经干细胞（NSC）接种于含玻璃盖玻片的6孔培养板中，每孔加入3 ml培养基，培养基成分为：杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12，500 ml）、2瓶N2添加剂（每瓶5 ml）、2瓶B27添加剂（每瓶10 ml）、10 ml青霉素-链霉素溶液（青霉素=10,000 单位/ml，链霉素=10,000 单位/ml）、1 ml 2-巯基乙醇（储存液：50 mM）以及层粘连蛋白（1/500），不添加生长因子。
   关键步骤：添加细胞时需缓慢旋转加样，操作务必轻柔，以减少细胞聚集。
3. 移除原有培养基，加入含有新鲜层粘连蛋白溶液（2 µg/ml）的新鲜N2B27培养基，以维持神经元在玻璃盖玻片上的贴附状态并防止细胞成团。每3天更换一次培养基。在更换新鲜培养基前，保留部分原有培养基（200 µl），以防细胞干燥。或者，也可快速操作并更换全部培养基体积（3 ml）。

2. 慢病毒转导

注意：绿色荧光蛋白（Green....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含钙、镁和酚红的 PD-PBS (1X)	Gibco/ Life Technologies	14190169
多聚-L-鸟氨酸溶液生物试剂	Sigma Aldrich	P4957
小鼠层粘连蛋白	Dutscher Dominique	354232
N2 添加剂	Gibco/ Life Technologies	17502048
不含维生素A的B-27添加剂 (50X)	Gibco/ Life Technologies	12587010
含谷氨酰胺-I的DMEM/营养混合物F-12	Gibco/ Life Technologies	31331028
Neurobasal 无血清培养基	Gibco/ Life Technologies	21103049
2-巯基乙醇	Gibco/ Life Technologies	31350-010
青霉素-链霉素	Gibco/ Life Technologies	15140-122
GFP 兔多克隆抗体	Gibco/ Life Technologies	A-6455
马血清	Gibco/ Life Technologies	16050130
Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体	Gibco/ Life Technologies	A11034
多克隆抗-betaIII微管蛋白抗体	Millipore	AB9354
13 mm 盖玻片	VWR	631-0150
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Gibco/ Life Technologies	P36931
Tween(R) 20 Bioextra，粘稠液体	Sigma Aldrich Chimie	P7949
Triton X-100	Sigma Aldrich Chimie	X100-100ML
人成纤维细胞	Coriell 细胞库	GM 4603 和 GM 1869	美国新泽西州卡姆登，Coriell 医学研究所
共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss（德国）	LSM 700
Imaris 软件	Bitplane AG, 苏黎世	6.4.0 版本	需使用 Filament Tracer 和 Imaris XT 模块
Huygens 软件	Huygens software, SVI, 荷兰	Pro 版本	可选（用于去卷积测试）