可视化培养星形胶质细胞中货物的细胞内运输

摘要

来源：Creighton, B. A., et al. 星形胶质细胞中细胞器及其他货物的细胞内运输的可视化与分析。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用一种选择性标记酸性内体-溶酶体囊泡的荧光酸性探针，在培养的星形胶质细胞中对细胞内货物运输进行可视化观察。通过共聚焦显微镜进行时间序列成像和Z轴层扫采集，可追踪整个三维细胞体积内荧光标记货物的动态。该分析能够区分静止的货物与向细胞周边或细胞核移动的货物，从而揭示细胞内运输的动力学特征。

方案

1. 转染荧光标记的质粒

1. 转染或标记前一日，以适合成像的密度接种星形胶质细胞，使其在转染后24−48小时达到所需状态。对于24孔板或14 mm玻璃底孔板，推荐接种密度为每孔2 × 10⁴个细胞。
   注意：本方案优化适用于采用脂质体转染法在24孔板中12 mm玻璃盖玻片上或14 mm玻璃底孔板中培养的星形胶质细胞。应根据星形胶质细胞所处培养皿的尺寸相应调整试剂用量。
2. 将脂质体转染试剂（材料表）用低血清培养基（材料表）稀释。为优化脂质体转染试剂与DNA的比例，应测试一系列合适的稀释浓度。例如，若使用本方案中所用的试剂（材料表），则将2、3、4和5 μL脂质体转染试剂分别加入50 μL低血清培养基中进行稀释。
3. 将5 μg高纯度DNA溶于250 μL低血清培养基中。加入5 μL脂质体转染增强试剂（材料表）。将含有脂质体转染试剂的管与等体积的DNA-转染增强剂混合液合并。通过移液混匀，并在室温（RT）孵育15分钟。
4. 移除星形胶质细胞培养基，将转染混合液（步骤1.3）逐滴加入细胞中。在37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时后，更换为适量的星形胶质细胞培养基（14 mm玻璃底培养皿每孔2 mL）。继续孵育24−72小时后再进行图像采集。应密切监控孵育时间，以在蛋白表达水平与细胞活力之间达到最佳平衡。

2. 使用荧光探针标记晚期内体/溶酶体

注意： 某些货物可通过使用对货物特异性蛋白具有高亲和力的荧光染料进行标记。以下示例允许使用荧光酸性探针标记晚期内体/溶酶体。

1. 将溶酶体标记探针（材料表）用200 µL星形胶质细胞培养基稀释至1 μM的工作浓度，并加入步骤1.1中密度为2 × 10⁴ 个细胞/孔的星形胶质细胞中。在37 °C下孵育30分钟。
2. 用预温的星形胶质细胞培养基洗涤细胞一次，更换为成像培养基（材料表），立即进行活细胞成像。

使用延时成像系统进行图像采集

注意：延时活体成像应使用配备高速相机、定焦系统、培养箱以及高数值孔径（例如 Plan-Apochromat 1.4NA）的40倍油镜的荧光显微镜进行。目前有多种可用于延时成像的采集软件。显微镜系统和采集软件的选择应基于其可及性以及与特定研究目标的匹配程度。以下提供一些通用指南。

1. 将培养皿或培养腔置于显微镜载物台上合适的适配器中。使用落射荧光光源，选择表达荧光蛋白或探针的细胞进行记录。调节荧光样品的照明强度，通过数码相机清晰观察所选细胞。避免使用过强的照明，以防光漂白和光毒性。调节焦距和放大倍数。
2. 使用变焦和定焦功能，以每2秒采集1帧的频率，获取单个Z轴层扫的时间序列图像，总时长在300秒至500秒之间。
   注意： 运输动力学参数（如速度、运动频率等）会因目标蛋白的不同而有所差异，因此采集的时间进程可能需要相应调整。例如，线粒体的运动性低于溶酶体，且常出现暂停现象。在此情况下，更合适的采集参数为每5秒采集1帧，持续800秒。
3. 保存时间序列图像，并将其导出为AVI或TIFF序列文件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM培养基（Dulbecco改良Eagle培养基）	Gen Clone	25-500
胎牛血清	Gemini	100-106	热灭活
FIJI（Fiji即ImageJ）	美国国立卫生研究院（NIH）	版本 1.52i
细尖镊子	F.S.T	11254-20	型号 #5
荧光光源	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
玻璃底培养皿	Mattek公司	P35G-1.5-14-C	35 mm培养皿 | 1.5号盖玻片 | 玻璃直径14 mm | 未包被
Graefe镊	F.S.T	11054-10	带弯曲尖端的Graefe虹膜镊
可标记酸性区室（晚期内体和溶酶体）的绿色荧光染料	Life Technologies	L7526	LysoTracker Green DND-26。预先溶于DMSO配制成1 mM储备液。使用时用生长培养基或所选缓冲液稀释至工作浓度。
汉克平衡盐溶液（10倍浓缩液）	Gibco	14065-056	无镁无钙
成像培养基	Life Technologies	A14291DJ	活细胞成像溶液
倒置共聚焦显微镜	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
脂质转染增强试剂	Life Technologies	11514015	Plus试剂
脂质转染试剂	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX试剂
轨道摇床培养箱	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230，带温度和转速控制的轨道摇床培养箱
青霉素/链霉素溶液（100倍浓缩液）	Gen Clone	25-512
磷酸盐缓冲液（10倍浓缩液）	Gen Clone	25-507x
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7405	用pH 8.5的Tris缓冲液溶解至1 mg/mL。长期保存需冷冻，避免反复冻融
低血清培养基	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
组织培养瓶	Olympus Plastics	25-209	75 cm²，100%倾斜颈设计，带0.22 µm疏水性通气滤膜盖
组织培养用培养箱	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i，带温度、湿度和CO₂控制的组织培养箱
Tris碱	Sigma	T1503	8.402 g Tris碱与4.829 g Tris HCl溶于1 L水中，配制成0.1 M Tris缓冲液，pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g Tris HCl与8.402 g Tris碱溶于1 L水中，配制成0.1 M Tris缓冲液，pH 8.5