免疫活性小鼠胶质母细胞瘤模型的生物发光成像

摘要

来源：Clark, A.J., 等. 胶质母细胞瘤免疫活性动物模型的生物发光成像。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了在免疫功能健全的小鼠模型中，利用表达荧光素酶的肿瘤细胞和荧光素，通过生物发光成像技术无创定量监测胶质母细胞瘤进展的方法。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. GL261 肿瘤生长的生物发光成像

1. 将足量的消毒剂（0.05% 氯化二甲基铵溶液）喷洒在一张洁净的纸巾上。使用浸有消毒剂的纸巾彻底擦拭成像室内的黑色底板、鼻锥和隔板，这些部位将与动物直接接触。随后用一张洁净干燥的纸巾彻底擦干所有表面。重复上述步骤一次，并静置5分钟。
2. 启动成像系统。
3. 通过腹腔注射方式，给予小鼠300 μl的混合溶液，其中包含200 μl的氯胺酮/赛拉嗪和100 μl的荧光素（D-荧光素钾盐，150 mg/kg）以进行麻醉。
4. 注射后等待10分钟，通过轻捏尾巴确认小鼠是否已完全进入麻醉状态。设置成像系统时，选择“生物发光”模式、“自动”曝光时间以及“中等”像素合并（binning）模式。将小鼠放置于成像台上，点击“采集”按钮开始成像。确保每次成像时距离注射的时间保持一致。
5. 成功获取图像后，应出现图像窗口和工具面板。点击感兴趣区域（ROI）或“ROI工具”，从圆形图标中选择“自动”模式。为定义感兴趣区域，在图像上圈选信号区域，然后以光子/秒/球面度/平方厘米（photons/sec/sr/cm²）为单位对ROI进行定量测量。
6. 将小鼠从成像室中取出，并持续观察直至其恢复自主活动能力并表现出正常行为。通常恢复时间约为15分钟。在小鼠完全从麻醉中恢复之前，不得将其放回与其他动物共用的笼具中。
7. 每周进行两次生物发光成像以监测肿瘤生长情况，直至动物出现以下症状：体重减轻（较植入前体重减少超过20%）、食欲减退（完全厌食持续24小时）以及对轻柔刺激缺乏持续的目的性反应（微弱地试图站立），此时应实施安乐死。
8. 将每天的发光强度数值相对于首次生物发光成像时的对应读数进行归一化处理（图1A）。
9. 对于统计分析，使用Kaplan-Meier法生成生存曲线，并采用对数秩检验（log-rank test）比较不同生存曲线之间的差异。

结果

图1. 荧光素酶表达不影响体内肿瘤生长和动物存活率。 （A）生物发光监测显示颅内植入的GL261.Luc（表达荧光素酶的GL261胶质母细胞瘤细胞）肿瘤在C57BL/6小鼠中呈进行性生长。（B）Kaplan-Meier生存分析显示，颅内植入GL261细胞（实线）或GL261.Luc细胞（虚线）的小鼠在总体生存率上无显著差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
D-荧光素钾盐	Gold Biotechnology	LUCK-100	避光保存
Living Image 软件	Caliper Life Sciences	Contact for Quote	无特殊要求
Xenogen Lumina	Caliper Life Sciences	Contact for Quote	无特殊要求
氯胺酮（Ketaset）	Pfizer	NDC 0856-2013-01	管制物质
赛拉嗪（Xylazine）	Sigma-Aldrich	23076-35-9	无特殊要求
28 G 针头（带注射器）	Fisher	22-004-270	又称胰岛素注射器
加热垫	Dunlap	HP950
PDI 酒精消毒片	Fisher	23-501-711