小鼠脑切片中血脑屏障的高分辨率三维共聚焦成像

摘要

来源：Villaseñor, R 和 Collin. L. 血脑屏障的高分辨率共聚焦成像：成像、三维重建与转胞吞作用的定量分析。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用共聚焦显微镜对血脑屏障（BBB）进行高分辨率三维成像，通过抗体染色的小鼠脑切片来分析血脑屏障的组分及细胞内结构，适用于研究脑稳态、神经血管相互作用以及与疾病相关的血脑屏障功能障碍。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 高分辨率共聚焦成像技术观察血脑屏障
2. 使用合适的激光扫描共聚焦显微镜进行图像采集（参见 材料清单使用405、488、561和633 nm激光线激发光谱中蓝色、绿色、橙色和红色区域的荧光染料。图像采集采用63倍油镜，数值孔径为1.4。
3. 在控制显微镜的软件采集菜单中设置图像采集参数。在“图像尺寸”下拉菜单中，选择1024 × 1024像素的数值。通过调整“缩放”菜单中的数值，将像素大小修改为200至300 nm之间的值。
   注意： 为分析细胞内结构，将像素大小减小至75 nm。此图像尺寸设置会显著增加采集时间，可通过将成像视野缩小至512 × 512像素来减少采集时间。
4. 在“采集速度”下拉菜单中，选择 400 Hz 的值， 即 每秒400行。在“系统设置”菜单中，选择“像素深度”下拉菜单，并将数值更改为12位。
5. 在显微镜软件的“采集”选项卡中，打开逐帧采集选项。通过调整“针孔”菜单中的数值，将每个通道的光学切片厚度设置为0.75至1 µm之间的值。
6. 在荧光激发面板中，启动用于最优激发样品中荧光染料的激光，例如，对于绿色发射的荧光染料，使用488 nm激光线。
   注意： 使用荧光团光谱查看器（参见 材料表选择合适的激发激光器。
7. 在荧光检测面板中，移动滑块以选择每个通道将要测量的波长范围，例如，对于绿色荧光染料，选择 510 至 550 nm 之间的波长。
   注意： 使用荧光团光谱查看器（参见 材料表）以选择合适的检测波长。
8. 在盖玻片上的脑切片上滴加一滴折射率为1.52的浸油，以匹配玻璃盖玻片和物镜的折射率。将样品置于显微镜下，打开落射荧光灯，通过显微镜双目镜观察样品。
9. 使用显微镜底座上的按钮，切换滤光片轮以选择适合观察DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色细胞核的滤光片。使用粗调焦旋钮将DAPI染色细胞核的信号调至清晰对焦。
10. 使用显微镜底座上的按钮切换滤光片，以观察血管标志物（例如 CollagenIV 或 CD31）的信号，并将视野中心对准单个毛细血管节段。
11. 按下按钮以启动实时扫描模式。扫描过程中，调节每个通道的增益和激光强度，以最大化图像的动态范围并避免像素饱和。
    注意： 使用查找表标记饱和像素，以直观评估过饱和情况。为避免信号过饱和，应使用预计荧光信号最强的样本调整成像参数。
12. 将线平均值设为2。
    注意： 当使用较高的采集速度时，增加此值以减少噪声。
13. 为获取覆盖毛细血管完整体积的光学z轴层扫图像，设定起始与终止范围，步长为0.45 µm。
    注意： 如果图像将用于后续定量分析，请对整个数据集保持相同的采集设置。
14. 为进行定量分析，需从至少三只不同的小鼠中，每只小鼠的每个切片采集10至20组z轴层扫图像，用于统计学比较。
    注意： 在同一实验过程中获取完整的数据集，以减少因样品漂白和激光强度波动引起的变异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗 CD31/PECAM 的大鼠单克隆抗体克隆 ER-MP12	Novus Biologicals	MCA2388	标记脑内皮细胞，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗大鼠 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
抗足蛋白聚糖（Podocalyxin）的大鼠单克隆抗体	R&D Systems	MAB1556	标记毛细血管管腔，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗大鼠 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
抗 CollagenIV 的兔多克隆抗体	Biotrend	BT21-5014-70	标记毛细血管基底膜，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗兔 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
抗 CD13 的山羊多克隆抗体	R&D Systems	AF2335	标记周细胞，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗山羊 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
偶联 Cy3 的抗 GFAP 的小鼠单克隆抗体克隆 G-A-5	Abcam	ab49874	标记星形胶质细胞，使用 1:100 稀释度
抗 Iba-1 的兔多克隆抗体	Wako	019-19741	标记小胶质细胞，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗大鼠 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
抗 LAMP2 的大鼠单克隆抗体 ABL93	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	标记溶酶体，使用 1:100 稀释度，用偶联合适 AlexaFluor 染料的驴多克隆抗大鼠 IgG (H+L) 检测，稀释度为 1:400
偶联 AlexaFluor594 的抗小鼠 IgG (H+L) 驴多克隆抗体	LifeTechnologies	A21203	使用 1:400 稀释度
偶联 AlexaFluor488 的抗小鼠 IgG (H+L) 驴多克隆抗体	LifeTechnologies	A21202	使用 1:400 稀释度
偶联 AlexaFluor555 的抗小鼠 IgG (H+L) 山羊多克隆抗体	LifeTechnologies	A21422	使用 1:400 稀释度
荧光封片介质	Dako	S3023	Dako 荧光封片介质
激光扫描共聚焦显微镜	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X，配备 HyD 检测器和白光激光器
图像处理软件	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF 版本 3.1.0 build 8587
图像分析软件	Bitplane scientific software	NA	Imaris 版本 7.6.5 build 31770（x64）
荧光光谱查看器	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html