利用比率型指示剂对原代神经元中的线粒体氧化还原状态进行成像

摘要

来源：Katsalifis, A., 等。利用比率型指示剂对原代神经元中线粒体谷胱甘肽氧化还原状态进行活体成像。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用比率型荧光探针在原代神经元中成像线粒体氧化还原状态的方法。通过在荧光显微镜下应用两种激发波长，测量荧光强度比值以评估线粒体氧化水平。该实验方案包括使用N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）刺激诱导钙离子内流和活性氧（ROS）的产生，随后使用氧化剂和还原剂进行校准，以定量分析NMDA诱导的线粒体氧化程度。

方案

1. 使用高氯酸四甲基罗丹明乙酯（TMRE）负载细胞

注意： 在本方案中，TMRE 以非淬灭模式使用，终浓度为 20 nM。通常应使用在所选显微镜下仍能提供足够信号强度的最低 TMRE 浓度。由于长期原代培养中蒸发不均，不同孔中的培养基体积可能存在差异。为确保各孔中 TMRE 浓度一致，请勿将 TMRE 直接加入孔中，而应将每孔的培养基更换为等量含 TMRE 的培养基。以下方案适用于每孔含有约 1 mL 培养基的 24 孔板中的原代神经元。

1. 在组织培养超净工作台中操作，从每个孔中收集 500 µL 培养基至一个锥形管中。
2. 每孔向锥形管中加入 0.5 µL 的 20 µM TMRE 储存液（例如，24 个孔共加入 12 µL）。
3. 小心吸去第一孔中剩余的培养基，并加入 500 µL 含 TMRE 的培养基。随后逐孔对剩余各孔重复此步骤。
   注意：注意避免细胞干燥，同时避免扰动细胞。
4. 将细胞放回培养箱，孵育至少 60 分钟，以确保染料充分平衡。
   注意：染料加载时间可延长至数小时，不会产生不良影响。
5. 为确保在整个成像实验过程中 TMRE 浓度一致并达到平衡状态，需在成像缓冲液及所有刺激溶液中维持 20 nM 的终浓度 TMRE。

2. 共聚焦显微镜扫描参数的优化

注意：此步骤旨在活体成像过程中，在图像质量与细胞活性之间找到最佳平衡。本节描述了用于氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP）成像的参数优化过程。若进行多参数成像，则需对其他指示剂同样进行类似的优化，包括确认基线稳定，且无光漂白或光毒性迹象。

1. 启动共聚焦显微镜，并加载用于GFP成像的标准设置（488 nm 激发，505 - 550 nm 发射）。
2. 将探测器设置为12位或16位。注意：通常，8位不足以满足定量成像的需求。
3. 启用顺序扫描模式，并添加第二序列/通道（405 nm 激发，505 - 550 nm 发射）。
4. 为两个通道选择一种能显示过曝和欠曝像素的伪彩查找表（例如，GLOW OU）。
5. 选择适合目标样本的物镜。
   注意：10x–40x适用于单细胞分析，63x–100x适用于单个线粒体分析。
6. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入1 mL成像缓冲液，并将成像室放置于显微镜载物台上。
7. 使用目镜和透射光对细胞进行调焦。
   注意：不要使用落射荧光光源来定位或聚焦细胞。即使在低功率下，这也会对细胞产生不利影响。
8. 以不同的像素格式采集图像。根据这些图像，选择能够清晰分辨目标结构的最低像素数。
   注意：通常，使用20x和40x物镜进行单细胞成像时，512 × 512像素效果良好；使用63x物镜进行单个线粒体成像时，1024 × 1024或2048 × 2048像素效果良好。
9. 以不同的针孔尺寸采集图像。根据这些图像，选择能够清晰分辨目标结构的最大针孔尺寸。
   注意：通常，3–7艾里单位（airy units）效果良好。
10. 以不同的激光强度采集图像。
    1. 相应地调整探测器增益和阈值。根据这些图像，选择能够提供可接受信号强度和信噪比的最低激光强度。
       1. 为确定信噪比，在包含细胞或线粒体的感兴趣区域（ROI1）以及不含细胞或线粒体的感兴趣区域（ROI2）分别测量信号强度，然后将ROI1的强度除以ROI2的强度。
          注意：目标信噪比应>3；在405 nm激发、激光功率为1–3%时，单个ROI的信号强度应为200–1,000；在488 nm激发、激光功率为1%时，单个ROI的信号强度应为300–1,500。
11. 以不同的扫描速度和帧平均数采集图像。每种设置组合下采集4–5幅图像。根据这些图像序列，选择能够提供可接受图像噪声和图像间变异性的最高速度和最低平均帧数。
    注意：在大多数情况下，600 Hz的扫描速度和1–2帧平均效果良好。
12. 使用新的盖玻片，采用优化后的设置记录时间序列图像。
    注意：时间序列的持续时间和图像采集间隔应与计划实验中的条件相似。
13. 在时间序列记录结束后，向成像室中加入1 mL 2x 二苯并亚胺（DA）溶液，继续成像2分钟。
14. 使用蠕动泵或手动移液器吸除成像缓冲液，加入1 mL 1x 二硫苏糖醇（DTT）溶液，继续成像5分钟。
15. 分析时间序列实验。
    1. 确认在使用优化设置进行DA和DTT处理期间，两个通道均未出现过曝或欠曝。
    2. 确保在时间序列记录过程中，任一通道均无明显荧光漂白；目标为第一幅与最后一幅图像之间的强度损失<2%。
    3. 确认405 nm与488 nm信号的比值在成像过程中无明显变化。
16. 使用多片盖玻片重复整个流程，通过迭代方式不断优化，直至确定能够稳定获得可接受结果的成像参数。

3. 基础氧化还原状态的评估

1. 启动显微镜，并加载第2节中的优化设置。
2. 将帧平均设置为3-5。
3. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入1 mL成像缓冲液，并将成像室放置在显微镜上。
4. 使用目镜和透射光对细胞进行聚焦。
   注意：请勿使用落射荧光光源来定位和聚焦细胞。即使在低功率下，这也会对细胞产生不利影响。
5. 切换至扫描模式，并使用488 nm通道在实时预览中进行聚焦并定位待成像的细胞。
6. 使用多点功能在盖玻片上选择3-5个视野。
7. 记录一幅基线图像。
8. 向成像室中加入1 mL 2x DA溶液。
9. 在1、2和3分钟时，使用实时预览确认或调整焦距，然后记录图像。
   注意：细胞通常在2分钟后完全氧化。
10. 将成像室中的缓冲液更换为1 mL 1x DTT溶液。
11. 在3和5分钟时，使用实时预览确认或调整焦距，然后记录图像。​
    注意：细胞通常在4-5分钟后完全还原。

4. 急性处理的活体成像

注意：以下方案描述了线粒体氧化还原反应在NMDA处理下的成像过程。对于其他处理方式，可能需要调整实验的成像时间间隔和持续时间。

1. 启动显微镜，并加载第3节中的优化设置。
2. 将延时成像间隔设为30 s，持续时间设为25 min。
3. 将带有细胞的盖玻片装入成像室，加入1 mL成像缓冲液，然后将成像室放置在显微镜载物台上。
   注意：为避免热漂移导致的焦点偏移，在开始延时成像前，应将细胞在显微镜载物台上静置10–15分钟。
4. 使用目镜和透射光对细胞进行聚焦。
   注意：请勿使用落射荧光光源来定位或聚焦细胞。即使在低强度下，这也会对细胞产生不利影响。
5. 切换至扫描模式，并在实时预览中使用488 nm通道对细胞进行聚焦和定位。
6. 可选：为增加每次运行中记录的细胞数量，可使用多点成像功能，在每张盖玻片上采集2–3个视野。
7. 开始延时图像采集，并记录5张图像作为2分钟的基础值记录。
8. 向成像室中加入500 µL的3倍浓度NMDA溶液（终浓度为30 µM），并继续记录20张图像，作为10分钟的NMDA反应记录。​
   注意：神经元对渗透压变化极为敏感。因此，务必尽量减少成像缓冲液的蒸发。对于较长时间的处理，应使用盖子覆盖成像室。
9. 向成像室中加入500 µL的4倍浓度DA溶液，并再记录6张图像（最长3分钟校准）。
10. 吸除成像室中的缓冲液，替换为1 mL的1倍浓度DTT溶液。再记录10张图像（最短5分钟校准）。
11. 结束记录，并保存图像序列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
二甲基二硫代氨基甲酸酯（DA）	Sigma-Aldrich	D3648
二硫苏糖醇（DTT）	Carl Roth GmbH	6908.1
蔗糖	Carl Roth GmbH	4621.1
高氯酸四甲基罗丹明乙酯（TMRE）	Sigma-Aldrich	87917
设备
成像腔室	Life Imaging Services (Basel, Switzerland)	10920	Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
激光扫描共聚焦显微镜，显微镜主体	Leica	DMI6000
激光扫描共聚焦显微镜，扫描单元	Leica	SP8
蠕动泵	VWR	PP1080 181-4001
转盘共聚焦显微镜，相机	Hamamatsu	C9100-02 EMCCD
转盘共聚焦显微镜，培养系统	TokaiHit	INU-ZILCF-F1
转盘共聚焦显微镜，显微镜主体	Nikon	Ti microscope
转盘共聚焦显微镜，扫描单元	Yokagawa	CSU-X1