使用共聚焦显微镜对免疫标记的星形胶质细胞进行三维成像

摘要

来源：Bagheri, M., et. al. 星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用共聚焦显微镜对小鼠脑切片中荧光标记的星形胶质细胞进行成像。将脑切片置于合适的物镜下，选择相应的荧光染料和滤光片。在自动优化曝光后，设定扫描参数以确保获得高分辨率的二维图像。配置Z轴层扫参数，并采集三维图像。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 动物、手术与标本制备

注意：为三维（3D）共聚焦显微镜分析准备脑组织。

1. 将动物随机分为两组：淀粉样蛋白β（Aβ)_1-40‒注射（n = 8），以及 Aβ_1-40‒接受染料木素处理的注射组（n = 8）：手术前1小时通过灌胃给予染料木素（10 mg/kg，溶于聚氧乙烯蓖麻油等溶剂中）。
2. 用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾后无回缩反射确认麻醉效果。手术期间在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。
3. 将动物置于立体定位仪中，剃除头部毛发。切口前用碘溶液清洁头皮，并在手术过程中保持手术区域无菌，以降低感染风险。注射 Aβ_1-40 立体定位地（4 µl) 在海马体中，位于前囟后方 −3.5 mm 处， ± 距中线外侧2 mm，硬脑膜下2.8 mm，依据大鼠脑图谱。
4. 术后应进行观察和护理，直至动物完全清醒，以确保其舒适。恢复期间保持动物体温，未完全恢复前不得将其放回与其他动物共处的笼具中。术后需密切注意动物是否有感染迹象。
5. 手术三周后，使用氯胺酮（150 mg/kg）对动物进行深度麻醉。经心脏灌注固定，先用0.9%生理盐水灌流，随后用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）配....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
淀粉样蛋白β 1-40	Sigma Aldrich	79793	保存于 -70 °C
染料木黄酮	Sigma Aldrich	446-72-0	保存于 -20 °C
抗胶质纤维酸性蛋白的兔多克隆抗体	DAKO	Z0334
碱性磷酸酶标记的猪抗兔IgG抗体	DAKO
液体永久性显色剂	DAKO	K0640
液体永久红底物缓冲液	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	聚氧乙基化蓖麻油 - 步骤 1.1
LSM 700 共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
图像分析 2000	Tekno Optic
立体定位仪	Stoelting
GraphPad Prism 5	GraphPad Software Inc.