使用共聚焦显微镜对免疫标记的星形胶质细胞进行三维成像

摘要

来源：Bagheri, M., et. al. 星形胶质细胞三维共聚焦形态计量分析方案。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了使用共聚焦显微镜对小鼠脑切片中荧光标记的星形胶质细胞进行成像。将脑切片置于合适的物镜下，选择相应的荧光染料和滤光片。在自动优化曝光后，设定扫描参数以确保获得高分辨率的二维图像。配置Z轴层扫参数，并采集三维图像。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 动物、手术与标本制备

注意：为三维（3D）共聚焦显微镜分析准备脑组织。

1. 将动物随机分为两组：淀粉样蛋白β（Aβ)_1-40‒注射（n = 8），以及 Aβ_1-40‒接受染料木素处理的注射组（n = 8）：手术前1小时通过灌胃给予染料木素（10 mg/kg，溶于聚氧乙烯蓖麻油等溶剂中）。
2. 用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾后无回缩反射确认麻醉效果。手术期间在眼睛上涂抹眼膏以防止干燥。
3. 将动物置于立体定位仪中，剃除头部毛发。切口前用碘溶液清洁头皮，并在手术过程中保持手术区域无菌，以降低感染风险。注射 Aβ_1-40 立体定位地（4 µl) 在海马体中，位于前囟后方 −3.5 mm 处， ± 距中线外侧2 mm，硬脑膜下2.8 mm，依据大鼠脑图谱。
4. 术后应进行观察和护理，直至动物完全清醒，以确保其舒适。恢复期间保持动物体温，未完全恢复前不得将其放回与其他动物共处的笼具中。术后需密切注意动物是否有感染迹象。
5. 手术三周后，使用氯胺酮（150 mg/kg）对动物进行深度麻醉。经心脏灌注固定，先用0.9%生理盐水灌流，随后用0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）配制的4%多聚甲醛灌流，然后取出脑组织并固定。
6. 用4%多聚甲醛在4℃下固定脑组织2-3天 ˚C.
7. 使用组织包埋设备将组织包埋于石蜡块中，注意避免包埋盒填充不足或溢出，以免影响后续的正确对位或切片。注意组织在石蜡块中的方向。
   注意： 例如，大鼠的海马靠近大脑半球的后部。因此，包埋组织时应使切片从脑的后部开始。使用Paxinos图谱作为参考，以定位目标解剖结构。
8. 将切片机放置在远离气流或门口的位置，因为空气流动会使切片操作变得困难。
9. 使用厚度≥20的切片 µm，因为需要此深度来生成完整的星形胶质细胞Z轴层析图像。不要使用最开始的几个切片，因为它们可能由于热膨胀而具有不理想的厚度。
10. 将切片置于温水（5℃）表面 ± 2 ˚C（略低于石蜡的熔点）保持足够时间以展平切片。
    注意： 过度展开切片会破坏结构的形态。使用极细的画笔小心转移切片。每张载玻片上收集两到三片切片。
11. 将载玻片置于直立的染色架中，在37℃下干燥 ˚数小时或过夜（O/N）

2. 免疫组织化学

1. 用二甲苯脱蜡，2次，每次10分钟，然后通过酒精梯度（99.8%、95%和70%，各10分钟）水化，最后置于PBS中。
2. 在含有0.25%牛血清白蛋白（BSA）、0.25% Triton X-100和3.5%正常血清的PBS中，按1:1,500稀释抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体，4 °C过夜孵育 ˚C）。
3. 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
4. 孵育碱性磷酸酶偶联的二抗1小时（1:100，21˚C，用PBS稀释。
5. 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
   注意： 正确清洗二抗后的切片对于尽量减少背景染色至关重要。
6. 在避光条件下，将切片与液态永久红发色剂共同孵育（15–20 分钟）。
   注意： 使用前不超过30分钟配制该溶液。
7. 用 PBS 清洗切片，每次 5 分钟，共 3 次。
8. 最后，在盖片前用4-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；1:500，用PBS稀释）对细胞核进行染色。将载玻片置于冰箱中保存24–48小时后再进行显微镜观察。

3. 共聚焦显微镜

注意：进行定量评估（见下文）时，应选择一个DAPI染色细胞核清晰可见且分支重叠最少的星形胶质细胞，以降低误差风险。生成Z轴层扫图像耗时较长，请耐心操作，并在处理过程中不要中断。使用直立式共聚焦激光扫描显微镜来获取星形胶质细胞的三维图像。

1. 将玻片放置在显微镜载物台上，选择63X物镜。
2. 打开成像软件，点击“Start System”，然后点击“Locate”选项卡。进入“Assign”界面，选择GFP以调节合适的光源。
3. 打开快门以反射光线。在快门右侧找到反射镜转盘（Reflector Revolver），选择星形胶质细胞应反射的颜色（绿色、红色或紫色）；本实验中使用红色（FSet20 wf）。
   注意：切勿忘记直接通过显微镜的目镜对图像进行聚焦。
4. 为获得最佳焦距，先点击“All Closed”，将显微镜针孔设为屏幕模式，然后点击“Acquisition”选项卡。
5. 在“Acquisition”选项卡下点击“Smart Setup”，弹出窗口后，从列表中选择合适的荧光染料（在本项目中为DAPI和Alexa Fluor 555）。颜色将被自动选定。
6. 点击“Best Signal”和“Apply”，然后点击“Set Exposure”；计算机将自动设置曝光参数。
7. 为优化图像，进入“Channels”窗口。取消选中Track2，选中Track1，点击“Live”。如有需要，对图像进行聚焦。
8. 在“Channels”窗口中调整以下参数：点击“1AU”以自动优化针孔大小。此步骤极为重要，若省略将导致共聚焦图像质量不佳。调节增益（Gain）以获得最佳强度（建议保持在800以下，以减少额外噪声）。最后，将数字增益（Digital Gain）设置在2至3之间。
9. 取消选中Track1，点击Track2，并重复步骤3.8对Track2进行设置，然后停止“Live”模式。
10. 进入“Acquisition Mode”窗口，通过优化帧大小（Frame Size）和平均扫描次数（Averaging）来改善图像质量。如需更改帧大小，请进入X*Y，选择1,024 x 1,024。选择较慢的扫描速度以获得更佳图像。
11. 进入“Averaging”设置，选择数值≥4。该平均值表示用于生成最终图像的扫描次数。随后点击“Snap”按钮，保存捕获的二维图像。
12. 如需进行三维成像，在“Smart Setup”下勾选“Z-Stack”选项，系统将打开Z-Stack窗口。
13. 设置Z-Stack的起始和终止位置，即细胞的深度。首先点击“Live”，然后使用显微镜的聚焦驱动装置，将焦点置于组织中星形胶质细胞的最上层位置（即Z-Stack起始点），点击“Set First”。接着，将焦点下移至星形胶质细胞在组织中的最低位置（即Z-Stack扫描终止点），点击“Set Last”。然后停止“Live”模式。
14. 选择间隔（Interval）；本研究中使用1.01 µm；也可点击“Optimal”按钮自动设定切片数量。
15. 点击“Start Experiment”开始实验。扫描完成后保存图像。该图像将用于测量以下参数：星形胶质细胞支配区域的表面积和体积，以及包含分支、胞体和细胞核在内的整个星形胶质细胞的总体积。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
淀粉样蛋白β 1-40	Sigma Aldrich	79793	保存于 -70 °C
染料木黄酮	Sigma Aldrich	446-72-0	保存于 -20 °C
抗胶质纤维酸性蛋白的兔多克隆抗体	DAKO	Z0334
碱性磷酸酶标记的猪抗兔IgG抗体	DAKO
液体永久性显色剂	DAKO	K0640
液体永久红底物缓冲液	DAKO	K0640
Cremophor EL	Sigma Aldrich	27963	聚氧乙基化蓖麻油 - 步骤 1.1
LSM 700 共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss
Volocity 6.3	Perkin Elmer Inc.,
图像分析 2000	Tekno Optic
立体定位仪	Stoelting
GraphPad Prism 5	GraphPad Software Inc.