使用共聚焦显微镜对免疫标记的星形胶质细胞进行三维成像

所有涉及动物样本的程序都经过适当的动物伦理审查委员会的审查和批准。

1. 动物、手术和标本制备

：准备用于三维 （3D） 共聚焦显微分析的脑组织。

1. 动物随机分为两组：β淀粉样蛋白（Aβ）_1-40\u2012注射液（n = 8）和染料木黄酮治疗的Aβ_1-40\u2012注射液（n = 8）;在手术前1小时通过灌胃给予染料木黄酮（10mg / kg在载体中稀释，如聚乙氧基化蓖麻油）。
2. 用氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉动物。通过捏住脚趾后没有退缩反射来确认适当的麻醉。手术期间在眼睛上涂抹药膏以防止干燥。
3. 将动物放入立体定向装置中并剃光头。切口前涂抹碘溶液清洁头皮，手术过程中保持手术部位无菌，以降低感染风险。根据大鼠脑图谱，在前胯后-3.5mm，中线外侧±2mm，硬脑膜下方-2.8mm处的海马体中立体定位注射Aβ_1-40（4μl）。
4. 提供术后观察/护理，直至动物完全清醒，以确保动物的舒适度。在恢复期间保持动物温暖，在完全康复之前不要将它们与其他动物一起放回笼子里。手术后注意动物的任何感染迹象。
5. 手术后三周用氯胺酮（150mg / kg）对动物进行深度麻醉。通过用0.9%盐水灌注动物，然后在0.1M磷酸盐缓冲盐水或PBS（pH = 7.4）中灌注4%多聚甲醛来进行经心固定，然后取出并固定大脑。
在
6. 4°C下将大脑固定在4%多聚甲醛中2-3天。
7. 使用组织包埋设备将组织包埋在石蜡块中，并避免填充不足或过度填充盒，因为它可能会干扰正确的对齐或切片。注意石蜡块中组织的方向。
   注意：例如，大鼠海马体靠近大脑半球的后部。因此，组织应以切片从大脑后部开始的方式嵌入。使用 Paxinos 图谱作为指南，以达到所需的解剖结构。
将
8. 切片机放置在远离气流或门口的地方，因为空气流动使切片的处理变得困难。
9. 使用厚度为≥20μm的切片，因为该深度对于生成完整星形胶质细胞的Z-Stack图像是必要的。不要使用前几个部分，因为它们可能会因热膨胀而具有不想要的厚度。
将
10. 切片放在温水表面（5 ± 2 °C，低于石蜡的熔化温度）上，长度刚好足以使切片变平。
    注意：切片的过度膨胀会扰乱结构的形态。使用小画笔小心地转移各个部分。在每张幻灯片上收集两到三个部分。
将
11. 载玻片存放在直立的架子上，让它们在 37 °C 下干燥数小时或过夜 （O/N）。

2. 免疫组织化学

1. 二甲苯中脱蜡切片，2 x 10 分钟，并通过醇梯度（99.8%、95% 和 70%，各 10 分钟）和 PBS 再水化。
2. 与含有0.25%牛血清白蛋白（BSA），0.25%Triton X-100和3.5%正常血清（4°C时O/N）的PBS中以1：1,500稀释的神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体一起孵育。
在
3. PBS中洗涤切片3 x 5分钟。
4. 与二级碱性磷酸盐偶联抗体孵育 1 小时（1：100,21°C，在 PBS 中稀释）。
在
5. PBS中洗涤切片3 x 5分钟
   注意：在二抗后正确洗涤切片以尽量减少背景染色非常重要。
用
6. 液体永久红色显色剂在黑暗中孵育切片（15-20 分钟）。
   注意：使用前不超过30分钟制备溶液。
在
7. PBS中洗涤切片3 x 5分钟。
8. 最后，在盖滑之前用 4-6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI;1：500，在 PBS 中稀释）对细胞核进行染色。在显微镜检查前，将载玻片在冰箱中存放 24-48 小时。

3.共聚焦显微镜

：对于定量评估（见下文），选择具有清晰可见的DAPI染色细胞核且重叠分支最少的星形胶质细胞，以降低错误风险。生成 Z-Stack 图像非常耗时。请耐心等待，在处理过程中不要停止。正置共聚焦激光扫描显微镜用于创建星形胶质细胞的 3D 图像。

1. 载玻片放在显微镜载物台上，然后选择 63X 物镜。
2. 打开映像软件并单击开始系统。单击"定位"选项卡。转到分配并选择 GFP 以调整适当的光线。
3. 打开快门以反射光线。找到快门右侧的反射器左轮手枪，选择星形胶质细胞应该反射的颜色（绿色、红色或紫色）;这里使用了红色（FSet20 wf）。
   注意：不要忘记将图片直接聚焦在显微镜的目镜中。
4. 要找到最佳焦点，请单击"全部关闭"，将显微镜引脚置于屏幕模式，然后单击"采集"选项卡。
5. 单击"采集"选项卡下的"智能设置";将打开一个窗口。从列表中选择适当的荧光团（即当前项目中的 DAPI 和 Alexa Fluor 555）。颜色会自动选择。
6. 单击最佳信号和应用，然后单击设置曝光;然后计算机将自动设置曝光参数。
7. 要优化图像，请转到"通道"窗口。取消标记 Track2，突出显示 Track1 并单击 Live。如果需要，将焦点放在图像上。
8. 在"通道"窗口中，调整以下键;单击 1AU 可自动优化针孔。执行此步骤非常重要，否则共聚焦图像将不是最佳的。调整增益以获得最佳强度（将此设置保持在 800 以下以减少额外的噪声）。最后，将数字增益设置为 2 和 3 之间。
9. 取消标记 Track1，单击 Track2，然后对 Track2 重复步骤 3.8。然后停止直播。
10. 转到"采集模式"窗口。通过优化帧大小和平均来改善图像。要更改帧大小，请转到 X*Y 并选择 1,024 x 1,024。选择慢速以创建更好的图像。
11. 转到平均并选择一个数字 ≥4。该平均值表示将平均以生成采集图像的扫描次数。现在，单击"捕捉"按钮并保存捕获的 2D 图像。
12. 对于 3D 成像，请在智能设置下标记 Z-Stack 项目，从而打开 Z-Stack 窗口。
13. 设置 Z-Stack 的第一个和最后一个位置，即单元格的深度。首先，单击"直播"。然后使用显微镜的聚焦驱动器聚焦在组织中星形胶质细胞的最上方位置，即 Z-Stack 开始的位置。单击"首先设置"。然后，聚焦到组织中星形胶质细胞的最低位置，应停止Z-Stack扫描。单击最后设置。然后停止直播。
14. 选择间隔;当前研究中使用 1.01 μm;选择间隔可以通过单击"最佳"来设置切片数来完成。
15. 单击开始实验。扫描完成后保存图像。该图像将用于测量以下参数：星形胶质细胞区域的表面积和体积，以及整个星形胶质细胞，包括分支、细胞体和细胞核。