活体小鼠脑内人神经前体细胞的生物发光成像

摘要

来源：Weber, R. Z., 等，小鼠脑内人神经前体细胞的颅内移植与活体生物发光示踪。J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了对注射到小鼠脑内的基因修饰人神经前体细胞进行活体生物发光成像的方法。该过程包括注射荧光素、成像前准备，以及在注射部位检测移植细胞发出的生物发光信号。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

活体成像

1. 荧光素的制备
   1. 在室温（RT）下解冻 D-荧光素钾盐，并用 PBS 配制 30 mg/mL 的新鲜储存液。
   2. 通过 0.22 µm 注射器滤器对储存液进行灭菌。
      注意：建议立即使用工作液。如有必要，溶解后的荧光素可在 -20 °C 下保存。但长期储存可能导致信号降解。荧光素为光敏性试剂，应尽可能避免直接光照。也可考虑使用其他底物（如 cycluc）以提高分辨率极限。
2. 成像
   1. 初始设置
      注意： 生物发光成像使用一种 体内 成像系统（参见材料表），该系统由暗室和冷却电荷耦合器件（CCD）相机组成。
      1. 双击 Living Image 软件图标，并从下拉列表中选择一个用户 ID。
      2. 在出现的控制面板中点击“初始化”。初始化完成后，控制面板中的温度指示框将变为绿色。
      3. 在控制面板中勾选“发光”和“拍照”选项，选择自动曝光（约 60 秒）。选择视野（本方案选用 D/12.5 cm），输入动物高度（1.5 cm），并选择“使用动物高度对焦”选项。手动设置以下参数：大 binning、f/2、阻断激发滤光片、打开发射滤光片。
   2. 确定 D-荧光素的注射剂量为每公斤体重 300 mg。
      注意：推荐的标准剂量为每公斤体重 150 mg D-荧光素。本实验根据一项使用 300 mg/kg 以提高灵敏度的方案进行了调整。
   3. 通过腹腔注射（i.p.）给予荧光素。​
      注意：如果动物在注射前需要镇静，请注意这可能会延长荧光素酶表达峰值的时间。
   4. 注射后等待 5 分钟，然后在成像过程中通过持续供给异氟烷（诱导阶段为 4.5%，维持阶段为 1.5–2%）对动物进行麻醉。
   5. 为动物眼部涂抹眼用润滑剂，然后使用普通剃毛器对其头部区域进行剃毛。将动物放入成像室，并在荧光素注射后 15 分钟点击控制面板上的“采集”按钮开始成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
耗材
注射器滤器；0.22 µm	TPP	99722
仪器设备
加热垫			自行选择的产品
活体成像系统（IVIS Lumina III，配备 Living Imaging 4.2 软件包）	Perkin Elmer	CLS136334
异氟烷蒸发器	Provet AG	330724
药品与试剂
D-荧光素钾盐	Perkin Elmer	122799
乙醇；70%			自行选择的产品
异氟烷（Isofluran (1-氯-2,2,2-三氟乙基-二氟甲基­醚) 99.9%）	Provet AG	所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供
眼用润滑剂（棕榈酸视黄醇：15,000 UI）	Bausch & Lomb Swiss AG	所有药品均由瑞士苏黎世州药房提供