利用相干反斯托克斯拉曼光谱成像小鼠脑组织中的髓鞘化神经元

摘要

来源：McCullagh, E. A., 等。相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）在脑切片髓鞘成像中的应用。J. Vis. Exp. (2022)

该视频展示了荧光成像与相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）成像技术，用于可视化啮齿类动物脑组织中的神经元结构。尼氏染色通过结合核糖体RNA对细胞体进行标记，而CARS成像则利用激光诱导信号靶向富含脂质的髓鞘。将荧光图像与CARS图像叠加，可清晰呈现细胞体与有髓轴突的精细结构。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 染色

1. 将游离切片用尼氏染色法染色（1:100），以观察细胞体，在抗体孵育液（AB液：0.1 M 磷酸缓冲液（PB：50 mM KH2PO4，150 mM Na2HPO4），150 mM NaCl，3 mM Triton-X，1% 牛血清白蛋白（BSA））中室温下于普通实验室摇床上孵育30分钟。
   1. 使用铝箔和/或盖子保护切片免受光照。波长在550 nm及以下适用于CARS成像 （图1）。
      注意： 尽管我们认为Triton-X或其他试剂对脂质的CARS成像无影响，但使用特定抗体孵育液时仍建议增加相应的对照实验。
2. 暂停点：将游离切片（避光条件下）保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至成像。脑组织切片制备后，应在两周内完成成像。

2. 成像

注意： CARS 激光系统包含一个提供 80 MHz 时钟的光纤激光器，以及一个光学参量振荡器（OPO）激光器，其可调范围为 770–990 nm，斯托克斯光束固定在 1031 nm，用于采集 CARS 信号。两束光共用一个光阑。

1. 在将样品送至显微镜之前，开启CARS激光器并预热至少1小时，对CARS激光进行校准，并对显微镜的聚光镜光学系统和光圈进行科勒照明（Koehler）调节，以实现前向CARS成像。注意：此步骤对CARS显微镜的正常运行至关重要。
   1. 为实现两束激光（泵浦光和斯托克斯光）的空间对准，通过CARS激光器的图形用户界面（GUI）访问两个内部位置敏感探测器（PSD）。
   2. 利用CARS激光器GUI中的延迟功能实现时间对准，该功能可帮助重叠由于波长不同而产生不同色散的两束激光脉冲。因此，泵浦光和斯托克斯光束的时间和空间重叠均通过GUI由用户输入完成。
   3. 调节外部潜望镜（装置的最后两个反射镜），使空间上已重叠的两束激光准确对准显微镜扫描头的反射镜。
   4. 为获得最佳的前向CARS非共聚焦检测效果，请确保聚光镜已完成科勒照明调节（即聚光镜已居中并对焦于光圈，以实现均匀照明）。
2. 对于免疫荧光共聚焦成像和CARS成像，将配备前向和背向（epi）CARS非共聚焦检测器（NDDs）的CARS激光器，与一台配有可见光激光器用于荧光成像的共聚焦显微镜整合在一起 （图2）。
3. 将切片置于带有盖玻片的培养皿中（用于倒置显微镜观察），加入PBS以防止组织干燥，并使用玻璃压片使组织紧贴盖玻片。
4. 使用60倍、数值孔径（NA）为1.2的红外校正水浸物镜获取z轴层扫图像或单张图像，该物镜可用于收集背向CARS信号，并通过0.55 NA的聚光镜收集前向CARS信号，以成像如斜方体旁正中核（MNTB）等脑区。
   1. 通过CARS激光器GUI，使用约600 mW的泵浦/探测光和300 mW的斯托克斯光进行CARS成像。这些激光功率值由系统内部测量。在样品位置处，两束激光的功率均低于25 mW，对组织样品是安全的。
   2. 在空间和时间上重叠泵浦光和斯托克斯光束。将OPO调谐至797.2 nm，从而产生650 nm的CARS波长。由于处于较高能级，返回基态时产生的信号为反斯托克斯（蓝移）信号。
   3. 使用带通滤光片（640–680 nm）捕获背向或前向非共聚焦检测器中的CARS信号，随后依次检测免疫荧光标记（本例中为荧光标记的尼氏染色）。注意：尼氏神经元胞体标记物不会被CARS 640–680 nm带通滤光片捕获，因此可在下述图像中实现荧光与CARS成像的结合。
   4. CARS和荧光信号不共用PMT。使用这些设置以获得最佳脂质信号，从而选择性地成像脑区的髓鞘化情况。警告：必须对操作者进行激光束屏蔽保护
5. 将图像保存为.oib文件格式，以便导入图像分析软件进行进一步定量分析 （图3）。

结果

图1：CARS成像可与免疫荧光成像结合使用。 图表显示，CARS成像发生在660/640 nm的红光信号光谱范围内。该波长与绿光、蓝光或紫外光范围相距足够远，因此可将CARS信号与这些范围内的免疫荧光信号结合。具体而言，该图还标示了使用蓝色荧光染料标记的尼氏体（Nissl）的激发和发射光谱，该信号在本研究代表性结果采集过程中与CARS...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
染色：
AB 培养基：			1n 1,000 mL 的 Millipore H2O
磷酸盐缓冲液（PB）：
磷酸二氢钾	Sigma	P5655
磷酸氢二钠	Sigma	S7907
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma life science	A2153-100g
氯化钠	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS：
APE picoemerald 激光器	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
带通滤光片（420-520 nm）	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
带通滤光片（500-530 nm）	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
带通滤光片（640-680 nm）	Chroma Technology	HQ660/40m-2P
共聚焦显微镜	Olympus	FV1000
切片转移移液管	Fisher	13-711-7M
二向色长通滤光片 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
二向色长通滤光片 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
二向色短通滤光片 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C
玻璃压片（10 mm × 10 mm 硼硅玻璃棒）	Allen Scientific Glass Inc
多光子短通发射滤光片 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS