幼年斑马鱼侧线毛细胞中钙动力学的成像

摘要

来源：Lukasz, D., et al. 幼年斑马鱼侧线毛细胞的活体钙成像. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了使用共聚焦显微镜对麻痹的转基因斑马鱼幼鱼侧线毛细胞中钙离子内流进行的活体成像。通过液体脉冲对毛束施加机械刺激，可诱导钙离子经由机械转导通道和电压门控通道进入细胞，利用荧光指示剂可实时观察这一过程。该方法揭示了神经丘毛细胞中顶端和基底钙离子动态变化，阐明了其在感知水流运动中的作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 将幼鱼固定并固定于成像室中
   1. 在成像室的硅胶封装剂表面，用约 1 mL 含 0.04% MS-222 的胚胎缓冲液（E3 缓冲液）浸泡 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 幼鱼 1–2 分钟，直至幼鱼失去活动能力或对触碰无反应。
      1. 在体视显微镜下，将幼鱼置于灌流室中央，使其侧卧并紧贴硅胶封装剂表面。
         注意：为保持一致性，应始终将幼鱼以同一侧朝下方式固定（例如右侧朝下，左侧朝上）（图 2B1）。
   2. 使用精细镊子，将一根 0.035 mm 的头部固定针垂直于幼鱼和成像室表面下压，将针插入眼睛与耳囊之间，并刺入封装剂中（图 1B1 和 1B2）。在固定过程中，使用另一把镊子稳定幼鱼的背侧或腹侧。确保针的水平部分接触幼鱼，但不完全压入封装剂内。将针向腹侧倾斜（图 1B1），或略微指向鱼体前部，以避免干扰后续的心脏注射和毛细胞成像。
      1. 使用镊子，将一根 0.025 mm 的尾部固定针尽可能靠近尾部末端插入脊索中（图 1B1）。
         注意：操作时需小心，避免拉伸幼鱼。应将幼鱼平整固定，使双眼重叠（图 2B1）。这一点对于顺利进行心脏注射（图 1B2-B2'，步骤 3）、获得理想的成像平面（图 1B1-B2''，步骤 5）以及量化液流刺激强度（图 3A3，步骤 4）至关重要。
2. 向心脏腔内注射 α-银环蛇毒素以麻痹幼鱼

注意： 操作α-银环蛇毒素时需佩戴手套。

1. 使用前将α-银环蛇毒素分装样品短暂离心，以防止堵塞心脏注射针头。
   1. 使用凝胶上样枪头吸取3 µL α-银环蛇毒素溶液，回填至心脏注射针头中。将溶液均匀装入针尖，避免产生气泡。
   2. 将心脏注射针插入连接至手动显微操作仪的移液器架中。在体视显微镜下，调整针头位置，使其与固定并麻醉的幼虫的前后轴（A-P轴）垂直，并以约30°的角度向下对准。
   3. 将移液器支架连接至压力注射仪。应用以下建议设置：注射压力 = 100 hPa，注射时间 = 0.5 s，补偿压力 = 5 hPa。向溶液中注射一剂液体，以检测针尖是否通畅。
   4. 观察针尖处是否有少量红色溶液（来自酚红）喷出。若未见红色，可非常轻柔地将针尖在图钉边缘轻轻刮擦，然后再次尝试，直至针头通畅。必要时，可换用针尖开口较大的针头。
2. 将针头向心脏方向推进，直至接触心脏外部的皮肤图1B2）。将针头刺入幼虫体内，观察心脏前方皮肤上色素细胞是否凹陷，以确认针头相对于幼虫处于正确的层面图1B2').
   1. 继续推进针头，直至刺穿皮肤并进入心腔。将针头稍向后撤。向心腔内注射一剂α-银环蛇毒素。观察心腔是否膨胀或有红色染料进入心腔。
3. 轻轻用1 mL神经元缓冲液（NB）冲洗幼虫3次，以去除残留的MS-222。切勿将液体完全吸除。在灌流室中保持幼虫悬浮于约1 mL的NB中。
   注意： 确保幼虫在固定和心脏注射后直至整个成像实验过程中，心跳和血流保持强劲。
4. 显微镜与液流喷射装置的制备
   1. 使用材料表中所述组件组装一台直立式共聚焦显微镜：配备488 nm激光器及相应滤光片的共聚焦显微镜、用于控制和协调成像与刺激的显微镜软件、10倍干镜物镜、60倍水镜物镜、压电-Z物镜扫描器（用于z轴层扫）、高速相机、圆形培养皿适配器、电动载物台和载物台插入式适配器。
   2. 组装由三个主要部件构成的流体喷射装置：真空与压力泵、高速压力夹、以及头部装置（详见材料表）。使用高速压力夹来控制从头部装置向流体喷射移液管释放压力或真空的时间和持续时长。
      1. 将前置放大器的输出端连接至液体喷射移液管支架 通过 厚壁硅胶管
5. 幼虫与液流喷射的对准

注意： 每个神经丘内存在三个关键层面：（1）纤毛束顶端（图3A3：动纤毛，用于测量刺激强度）；（2）纤毛束机械转导（MET）层面（图2B1-B1'：位于顶端纤毛束基部，可检测依赖于MET通道的钙信号）；以及（3）突触层面（图2B2-B2'：在毛细胞基部检测到突触前钙信号的位置）。这些层面在图2A中进行了示意标注。

1. 使用凝胶上样枪头，将10 µL NB溶液回填至已正确断裂的液流喷射针中。将溶液均匀地吸入枪头，避免产生气泡。将针头插入连接到电动显微操作器的移液管支架中。
2. 将灌流腔室放置在显微镜载物台上的圆形腔室适配器中。注意：为保持一致性，始终以相同方向放置幼鱼（例如，使幼鱼的尾部朝向液流喷射方向，腹侧朝向实验操作者）。
   1. 移动电动载物台，使幼鱼位于视野中央。旋转圆形腔室适配器，使幼鱼的前后（A-P）轴大致与液流喷射针的运动轨迹对齐。
   2. 使用透射光和微分干涉差（DIC）成像，将幼鱼调至清晰对焦，并使其位于10倍物镜正下方。升起10倍物镜。
3. 使用电动显微操作器，将液流喷射针下移至视野中心，使其被透射光照明，并轻微接触NB溶液。
   1. 降下10倍物镜。对焦幼鱼以确认其位置。向上对焦以找到液流喷射针。使用显微操作器在x轴和y轴方向移动液流喷射针，使其与鱼体背侧大致平行。
   2. 重新对焦幼鱼。沿z轴方向将针头下移。将针头定位在鱼体背侧，并距离身体约1 mm（图3A1）。
   3. 如有必要，小心移动圆形腔室适配器，确保液流喷射针与幼鱼的前后中线对齐（图3A1）。
   4. 移动电动载物台，使目标神经丘位于视野中央。保持液流喷射针尖端位于鱼体背侧。切勿让液流喷射针尖接触幼鱼或腔室表面。
4. 切换至60倍水浸物镜。确保物镜浸没在NB溶液中。使用透射光和DIC光学系统，通过微调焦距定位神经丘。
   注意：该设置旨在刺激后侧线主干上的神经丘。这些神经丘中的毛细胞可响应前向或后向的液体流动。
   1. 使用显微操作器调整液流喷射针位置，使其距离神经丘外缘100 µm（图3A2）。
      注意：应选择提供清晰俯视图的神经丘（图2B1'-B2' 和 图3A3），而非侧视角度的神经丘（图2C1-C2）。清晰的俯视图可在单个光学平面内同时成像所有顶端纤毛束，或在较少的光学平面内成像突触区域（图3A3）。
   2. 向上对焦至顶端纤毛束（动纤毛）的尖端（图1A、图3A2 和 图3A3）。在此焦平面上，液流喷射针的底部也应处于清晰对焦状态。
5. 将高速压力钳从手动模式设为外部输入模式，以接收成像软件的信号输入。
   1. 按下“zero”按钮对高速压力钳进行归零。使用设定点旋钮将静息压力设为轻微正压（约2 mmHg）。通过连接至头段输出端的磅每平方英寸（PSI）压力计确认高速压力钳的静息输出。
      注意：设置轻微正压静息状态，以防止液体随时间逐渐进入液流喷射针。若液体进入连接液流喷射针的管路并到达头段，可能损坏设备。
   2. 确定刺激纤毛束所需的压力。使用0.125 V和0.25 V输入（即6.25 mmHg和12.5 mmHg），持续200–500 ms，施加测试刺激（图3A3-A3''）。
      注意：高速压力钳将电压输入（来自软件或其他连接至高速压力钳命令端口BNC接口的设备）转换为压力，该压力由头段释放，最终通过液流喷射针输出（1.0 V = 50 mmHg，-1.0 V = -50 mmHg）。在此配置下（见步骤4.2），正压（推）使纤毛束向前偏转，负压（拉）使纤毛束向后偏转。
   3. 结合透射光和DIC光学系统以及标尺，测量6.25 mmHg和12.5 mmHg刺激下纤毛束尖端（动纤毛）的偏转距离（图2A 和 图3A3-3''）。选择一个能使纤毛束（作为一个整体单元）偏转约5 µm的压力（图3A3''）。确保动纤毛尖端在整个过程中保持清晰对焦。
   4. 沿幼鱼的前后轴（A-P轴）移动液流喷射针±25 µm，以找到使动纤毛尖端偏转5 µm的距离和压力。
      注意：在受精后3–7天（dpf）的幼鱼中使用GCaMP6s时，5 µm的偏转应能实现接近饱和的GCaMP6s钙信号，且不会损伤顶端纤毛束结构（图3A3''）。可使用更小的位移距离施加非饱和刺激（图3A3'）。位移距离>10 µm时难以准确估计（图3A3'''），且长时间可能造成损伤。信号饱和程度取决于神经丘的年龄（及动纤毛高度）以及所使用的指示剂。在成像过程中应定期检查液流喷射针在两个方向（压力/推和真空/拉）的通畅性。液流喷射针易堵塞，且容易丧失真空通畅性，但仍可能保留部分压力通畅性。使用DIC光学系统和短时测试刺激在两个方向上检查液流喷射针的通畅性。
   5. 将样本对焦至目标焦平面（例如，顶端纤毛束基部或突触平面中毛细胞的基部；图2B1-B2'）。
6. 成像采集程序：单平面采集

注意：本方案中所述的所有成像操作均在室温（RT）下进行。

1. 将成像软件设置为以每100毫秒捕获一帧的速度连续采集80帧，以实现10 Hz的帧率。
2. 调节增益、光圈和激光功率以优化信号检测，但需避免信号饱和、光漂白和噪声。Opterra/SFC 系统的示例设置如下：488 nm 激光功率：50（毛细胞束 MET 平面），75（突触平面）；狭缝宽度 35 µm；增益 = 2.7；EM 增益 = 3900。
   注意： 若信号过弱、噪声过高或光漂白过于严重，可应用2倍像素合并。2倍像素合并将提高信号检测能力，但会降低空间分辨率。
3. 在第30帧（3秒）后，于80帧（8秒）采集期间选择一种刺激进行递送。
   注意： 一些刺激示例如下：在前向或后向施加持续200毫秒（±0.25 V）至2秒（±0.25 V）的阶跃刺激，以确定每个毛细胞的方向敏感性；施加持续2秒、5 Hz的方波刺激（0.25 V持续200毫秒，-0.25 V持续200毫秒，重复5次），以同时刺激所有毛细胞。正压（前向刺激）将激活一半毛细胞，负压（后向刺激）将激活另一半毛细胞。务必确保刺激软件或设备在刺激结束后将压力钳制恢复至0 V。
4. 测量机械敏感性钙反应。聚焦于顶端毛束的基部。图2A 和 2B1-B1'）并开始图像采集。
   注意： 如果从顶部清晰地观察到神经丘（neuromast）图2B1-B1'所有顶端毛束均可在单个平面上同时成像。
5. 测量突触前钙反应。聚焦于毛细胞的基部（图2A和图2B2-B2'）并开始图像采集。
   注意： 如果从上方清晰地观察到神经丘（neuromast）图 2B2-B2')，所有毛细胞的突触前成像平面可在相距2 µm的2–3个平面上获取。 Tg[myo6b:ribeye-mcherry] 转基因鱼可用于鉴定和定位突触前带状结构及钙离子进入位点。

结果

图1：成像室、斑马鱼幼鱼固定与心脏注射操作及针具。（A） 图示为一个成像室，其中幼鱼（由虚线矩形标出）被固定在硅胶封装材料中央。 （B1） 图示为一条5天龄幼鱼，通过两枚针固定使其 immobilized。一枚较大的头部固定针垂直于身体，置于眼睛后方稍远处。两只眼睛完全重叠，下方的眼睛被上方的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-银环蛇毒素	R&D Systems	2133	用于成像前使幼虫麻痹
成像室	Siskiyou	PC-R	用于固定幼虫以进行成像的平台
1.5号盖玻片，方形，22×22 mm	VWR	48366-227	用于密封成像室
高真空硅脂	Fischer Scientific	14-635-5D	用于将盖玻片固定到成像室上
透明硅胶封装剂，0.5 g 套件	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG	用于填充成像室，形成固定鱼类的表面
体视显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 配透射光照明	用于照亮制作用针所需的金属丝、镊子和剪刀
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 × 0.02 mm) 货号 11295-10	用于制作固定针
精细剪刀	Cole-Palmer	5.5英寸，EW-10818-00	用于切割钨丝以制作固定针
钨丝，0.035 mm	Goodfellow	W005131	用于制作头部固定针以固定幼虫
钨丝，0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	用于制作尾部固定针以固定幼虫
无内丝硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	用于拉制流体喷射针以刺激毛细胞
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 × 0.02 mm) 货号 11295-10	用于固定幼虫
凝胶加样枪头	Eppendorf	5242956003	用于回填心脏注射针
体视显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 配透射光照明	用于在固定幼虫和心脏注射过程中提供照明
玻璃毛细管/针持	WPI	MPH315	用于固定流体喷射针
手动显微操作器	Narishige	M-152	用于固定和定位针持，以注射α-银环蛇毒素
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定用于注射α-银环蛇毒素的手动显微操作器
压力注射仪	Eppendorf	Femtojet 4x	用于递送α-银环蛇毒素
共聚焦显微镜	Bruker	Swept field/Opterra 共聚焦显微镜	固定式直立显微镜，配备微分干涉差（DIC）光学系统、488 nm 激光及相应滤光片
显微镜软件	Bruker	Prairieview 5.3	用于协调和控制显微镜、激光、载物台、压电Z轴、相机和流体喷射系统
10倍空气物镜	Nikon	MRH00101	低倍率，用于幼虫和流体喷射针的定位
60倍水浸物镜	Nikon	MRF07620	高数值孔径（1.0）水浸物镜，工作距离充足（2.0 mm）
带控制器/驱动器的压电Z轴物镜扫描器	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	可实现高速Z轴堆栈采集，精度达0.025 µm
EMCCD相机	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD相机	具有小像素尺寸的相机，每秒可采集高达100帧图像
圆形腔室适配器	Siskiyou	PC-A	用于在显微镜载物台上固定和旋转成像室
电动Z轴平台	Prior Scientific	ZDN12MP	显微镜载物台，可同时固定并移动样品和带有流体喷射针的显微操作器
Z轴平台插入适配器	NIH 机械加工车间	定制	用于将圆形腔室适配器安装到Z轴平台上
流体喷射装置	ALA scientific instruments	HSPC-1 高速压力钳制系统，配PV-PUMP	用于控制和递送流体喷射刺激
Masterflex 过氧化物固化硅胶管（1英尺）	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	用于连接流体喷射针持与压力泵
电动显微操作器	Sutter Instrument Company	MP-225	用于固定和定位流体喷射针持
显微操作器控制器	Sutter Instrument Company	MPC-200	用于控制流体喷射针显微操作器
凝胶加样枪头	Eppendorf	5242956003	用于回填流体喷射针
玻璃毛细管/针持	WPI	MPH315	用于固定流体喷射针
PSI压力计	Sper Scientific	840081	用于测量压力钳制系统的输出压力
Prism7	Graphpad	Prism7	用于绘制GCaMP6荧光强度变化的软件
FIJI	Schindelin 等34	https://fiji.sc/	用于图像处理及生成时空信号图的软件
Turboreg 插件	Thévenaz 等29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	用于在FIJI中对GCaMP6图像序列进行配准的插件
StackReg 插件	Thévenaz 等29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	用于在FIJI中对GCaMP6图像序列进行配准的插件
Time Series Analyzer V3 插件	Balaji J 2007，加州大学洛杉矶分校神经生物学系	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	用于创建多个感兴趣区域（ROI）以测量GCaMP6荧光强度变化的插件