幼年斑马鱼侧线毛细胞中钙动力学的成像

摘要

来源：Lukasz, D., et al. 幼年斑马鱼侧线毛细胞的活体钙成像. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了使用共聚焦显微镜对麻痹的转基因斑马鱼幼鱼侧线毛细胞中钙离子内流进行的活体成像。通过液体脉冲对毛束施加机械刺激，可诱导钙离子经由机械转导通道和电压门控通道进入细胞，利用荧光指示剂可实时观察这一过程。该方法揭示了神经丘毛细胞中顶端和基底钙离子动态变化，阐明了其在感知水流运动中的作用。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会以及 JoVE 兽医评审委员会的审核。

1. 将幼鱼固定并固定于成像室中
   1. 在成像室的硅胶封装剂表面，用约 1 mL 含 0.04% MS-222 的胚胎缓冲液（E3 缓冲液）浸泡 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 幼鱼 1–2 分钟，直至幼鱼失去活动能力或对触碰无反应。
      1. 在体视显微镜下，将幼鱼置于灌流室中央，使其侧卧并紧贴硅胶封装剂表面。
         注意：为保持一致性，应始终将幼鱼以同一侧朝下方式固定（例如右侧朝下，左侧朝上）（图 2B1）。
   2. 使用精细镊子，将一根 0.035 mm 的头部固定针垂直于幼鱼和成像室表面下压，将针插入眼睛与耳囊之间，并刺入封装剂中（图 1B1 和 1B2）。在固定过程中，使用另一把镊子稳定幼鱼的背侧或腹侧。确保针的水平部分接触幼鱼，但不完全压入封装剂内。将针向腹侧倾斜（图 1B1），或略微指向鱼体前部，以避免干扰后续的心脏注射和毛细胞成像。
      1. 使用镊子，将一根 0.025 mm 的尾部固定针尽可能靠近尾部末端插入脊索中（

结果

图1：成像室、斑马鱼幼鱼固定与心脏注射操作及针具。（A） 图示为一个成像室，其中幼鱼（由虚线矩形标出）被固定在硅胶封装材料中央。 （B1） 图示为一条5天龄幼鱼，通过两枚针固定使其 immobilized。一枚较大的头部固定针垂直于身体，置于眼睛后方稍远处。两只眼睛完全重叠，下方的眼睛被上方的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
α-银环蛇毒素	R&D Systems	2133	用于成像前使幼虫麻痹
成像室	Siskiyou	PC-R	用于固定幼虫以进行成像的平台
1.5号盖玻片，方形，22×22 mm	VWR	48366-227	用于密封成像室
高真空硅脂	Fischer Scientific	14-635-5D	用于将盖玻片固定到成像室上
透明硅胶封装剂，0.5 g 套件	Ellsworth Adhesives	Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG	用于填充成像室，形成固定鱼类的表面
体视显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 配透射光照明	用于照亮制作用针所需的金属丝、镊子和剪刀
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 × 0.02 mm) 货号 11295-10	用于制作固定针
精细剪刀	Cole-Palmer	5.5英寸，EW-10818-00	用于切割钨丝以制作固定针
钨丝，0.035 mm	Goodfellow	W005131	用于制作头部固定针以固定幼虫
钨丝，0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	用于制作尾部固定针以固定幼虫
无内丝硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	用于拉制流体喷射针以刺激毛细胞
精细镊子	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 × 0.02 mm) 货号 11295-10	用于固定幼虫
凝胶加样枪头	Eppendorf	5242956003	用于回填心脏注射针
体视显微镜	Carl Zeiss Microscopy	Stemi 2000 配透射光照明	用于在固定幼虫和心脏注射过程中提供照明
玻璃毛细管/针持	WPI	MPH315	用于固定流体喷射针
手动显微操作器	Narishige	M-152	用于固定和定位针持，以注射α-银环蛇毒素
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定用于注射α-银环蛇毒素的手动显微操作器
压力注射仪	Eppendorf	Femtojet 4x	用于递送α-银环蛇毒素
共聚焦显微镜	Bruker	Swept field/Opterra 共聚焦显微镜	固定式直立显微镜，配备微分干涉差（DIC）光学系统、488 nm 激光及相应滤光片
显微镜软件	Bruker	Prairieview 5.3	用于协调和控制显微镜、激光、载物台、压电Z轴、相机和流体喷射系统
10倍空气物镜	Nikon	MRH00101	低倍率，用于幼虫和流体喷射针的定位
60倍水浸物镜	Nikon	MRF07620	高数值孔径（1.0）水浸物镜，工作距离充足（2.0 mm）
带控制器/驱动器的压电Z轴物镜扫描器	Physik Intruments instruments/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	可实现高速Z轴堆栈采集，精度达0.025 µm
EMCCD相机	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCD相机	具有小像素尺寸的相机，每秒可采集高达100帧图像
圆形腔室适配器	Siskiyou	PC-A	用于在显微镜载物台上固定和旋转成像室
电动Z轴平台	Prior Scientific	ZDN12MP	显微镜载物台，可同时固定并移动样品和带有流体喷射针的显微操作器
Z轴平台插入适配器	NIH 机械加工车间	定制	用于将圆形腔室适配器安装到Z轴平台上
流体喷射装置	ALA scientific instruments	HSPC-1 高速压力钳制系统，配PV-PUMP	用于控制和递送流体喷射刺激
Masterflex 过氧化物固化硅胶管（1英尺）	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	用于连接流体喷射针持与压力泵
电动显微操作器	Sutter Instrument Company	MP-225	用于固定和定位流体喷射针持
显微操作器控制器	Sutter Instrument Company	MPC-200	用于控制流体喷射针显微操作器
凝胶加样枪头	Eppendorf	5242956003	用于回填流体喷射针
玻璃毛细管/针持	WPI	MPH315	用于固定流体喷射针
PSI压力计	Sper Scientific	840081	用于测量压力钳制系统的输出压力
Prism7	Graphpad	Prism7	用于绘制GCaMP6荧光强度变化的软件
FIJI	Schindelin 等34	https://fiji.sc/	用于图像处理及生成时空信号图的软件
Turboreg 插件	Thévenaz 等29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	用于在FIJI中对GCaMP6图像序列进行配准的插件
StackReg 插件	Thévenaz 等29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/	用于在FIJI中对GCaMP6图像序列进行配准的插件
Time Series Analyzer V3 插件	Balaji J 2007，加州大学洛杉矶分校神经生物学系	https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	用于创建多个感兴趣区域（ROI）以测量GCaMP6荧光强度变化的插件