通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头

摘要

来源：Marinello, M.，等. 通过共聚焦与超分辨率显微镜联合表征小鼠神经肌肉接头.J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了如何利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜对大鼠肌肉组织中的神经肌肉接头进行制备、免疫染色、成像，以观察和分析突触前及突触后结构。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 准备

1. 使用两把精细的锯齿状镊子，将每块肌肉分离成宽度约为 1 mm 的小束纤维。

注意：使用镊子操作肌肉时必须非常轻柔，避免用力过度，以防在分离过程中造成组织损伤。

1. 根据胫骨前肌（tibialis anterior，TA）的大小，将其分离成3或4个肌束。

2. 对于腓肠肌（gastrocnemius，GA），分离肌肉的内侧和外侧部分，然后根据其大小将每一部分解离为4-5个肌束。

2. 免疫染色

1. 进行肌纤维透化处理：将肌束转移至含有1% (v/v) Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS）的24孔板中，在室温下轻轻振荡（50 rpm）孵育1小时，或在4 °C下孵育5小时。

注意：将肌肉束分置于两块培养板之间，以便分别进行免疫染色，并最大限度降低抗体混淆的风险。不要将其分入超过两个孔（每板1孔）；否则，所获得的能代表分析肌肉总体状态的神经肌肉接头（NMJs）数量（N）可能不足。

2. 在室温下用 PBS 洗涤样本 3 次，每次 5 分钟，然后在 4 °C 条件下，以含 4% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS/Triton X-100 1% 封闭液中孵育 4 小时，轻柔振荡（50 rpm）。

注意：洗涤步骤中不得使用抽吸泵，而应使用200 μL移液器和小号吸头手动抽吸溶液（参考产品见材料表）。

3. 在4 °C、轻柔振荡（50 rpm）条件下，用步骤2.2中指定的封闭液孵育样品过夜（O/N），封闭液中加入针对神经丝蛋白M（NF-M，2H3，稀释比例1/200）或突触小泡糖蛋白2（SV2，稀释比例1/200）的初级单克隆抗体，以分别标记突触前轴突末梢或活性区。

4. 次日，在振荡（50 rpm）条件下，用 PBS 清洗肌束 3 次，每次 5 分钟。

1. 共聚焦成像：将肌束与红色荧光染料标记的抗小鼠二抗（F594）（1/500 稀释）以及绿色荧光染料标记的α-银环蛇毒素（α-BTX-F488）（1/1000 稀释）在 PBS 中于室温下避光振荡孵育 2 小时（50 rpm）。

2. 用于受激发射损耗（STED）成像：将肌束与偶联绿色荧光染料（F488）的二抗（抗小鼠抗体）（稀释比例1/500）以及偶联远红荧光染料且具有高光稳定性的α-银环蛇毒素（α-BTX-F633）（稀释比例1/1000）在PBS中于室温下振荡孵育2小时（50 rpm）。

注意：孵育期间请勿将样品暴露于光线下，以避免光漂白。

5. 在振荡（50 rpm）条件下，用 PBS 清洗标记的肌束 3 次，每次 5 分钟，然后将其置于载玻片上，并加入封片介质。

注意：每张载玻片上最多放置 4 到 5 条肌束，以便密封。

6. 在顶部放置一个1.5号（或1.5H号）玻璃盖玻片（厚度为0.17 mm），并在载玻片两侧放置圆柱形磁铁，以施加压力并压平肌肉组织。

7. 将载玻片置于 4°C 避光孵育过夜。用指甲油永久封片。

3. 图像采集

1. 共聚焦显微镜的图像采集

注意：图像采用倒置激光扫描共聚焦显微镜，使用 63 倍油浸物镜（HCX Plan Apo CS，数值孔径（NA）为 1.4）采集。

1. 进行盲法分析时，让未参与分析的人员为每张切片编号。在完成所有样本的神经肌肉接头参数定量之前，始终保持对实验分组的盲态。

2. 以配置模式启动显微镜软件 > machine.xlhw。

3. 将玻片置于显微镜载物台上，使用DAPI滤光片组在DAPI宽场荧光照明下观察，找到样品中的观察平面。

4. 点击打开项目 > 新建项目 ，并创建一个文件夹以存储图像采集数据。

注意：每个神经肌肉接头（NMJ）应创建一个新项目，以限制文件夹大小并防止计算机内存问题。

5. 为设置采集参数，请点击采集选项卡窗口，将共聚焦针孔设为1.0艾里单位，并调节激光功率，以优化使用488 nm激光在需成像的终板（开启实时模式）上检测绿色/F488（α-BTX）荧光的增益和偏移水平。

6. 接下来，使用适用于F594观察的激光优化红色/F594（NF-M或SV2）荧光信号的采集。本研究中采用552 nm激光（开启实时模式）。设置各激光的染料发射光谱范围如下：405 nm激光（DAPI）为414–483 nm，488 nm激光（F488-α-BTX）为506–531 nm，552 nm激光（NF-M/SV2）为622–650 nm。

7. 以相同的设置采集各实验组神经肌肉接头的图像序列：图像大小为 1024 x 1024 像素（73.7 x 73.7 μm），采样频率 400 Hz，双向 X 扫描开启，缩放倍数 2.5，Z-Wide 模式下 Z 轴步进大小为 0.5 μm。

注意：对于每个神经肌肉接头（NMJ），需设置切片数量以获取完整的接头区域。上述采集设置符合奈奎斯特-香农采样定理。然而，用户可点击所有近期共聚焦操作系统软件中配备的“优化格式” 按钮，以确保像素大小和Z轴步进满足理想的奈奎斯特采样率。此操作可避免图像过采样或欠采样，从而防止体积测量精度的损失。

8. 将原始文件（.lif）或Z轴层叠图像（.tif）保存到一个文件夹中，文件夹名称应包含载玻片的代号、染色类型和终板编号。

注意：请依次（而非同时）使用 488 nm 和 552 nm 激光器（F488 和 F594）进行扫描，以避免 F488 荧光信号串扰至 F594 通道，反之亦然（即信号渗漏）。可通过显微镜软件中的染料助手（Dye Assistant）配置光路。

9. 更换至下一个编码的载玻片，并对每个神经肌肉接头重复步骤 3.1.3–3.1.8。

10. 会话结束时，单击“在3D查看器中打开” 并选择一个具有代表性的神经肌肉接头 实验组以可视化三维标记。

注意： 此视图模式有助于验证采集参数是否正确。

11. 关闭显微镜软件，使用镜头纸清洁物镜，然后关闭系统。

2. 使用 STED 显微镜进行成像

注意：图像采用配备775 nm门控STED的倒置激光扫描共聚焦显微镜，结合100倍油浸物镜（HC PL APO CS2 1.4 NA）采集。

1. 为进行盲法分析，请一位不参与分析的人员为每张切片分配一个编号。在完成所有样本的神经肌肉接头（NMJ）参数定量之前，始终保持对实验分组的盲态。

2. 以配置模式启动显微镜软件 > machine.xlhw 并开启 STED。

3. 单击打开项目 > 新建项目，以创建用于存储图像采集的文件夹。
注意： 为每张载玻片生成一个新文件夹，以限制文件夹大小并防止计算机内存问题。

4. 将玻片放置在显微镜载物台上，使用488 nm激光在宽场荧光照明下观察，以在样品中找到观测平面。

5. 使用488 nm激光，结合506–531 nm光谱检测范围，寻找经神经丝蛋白M（NFM）或SV2染色标记的神经肌肉接头。

6. 当识别到神经肌肉接头（NMJ）后，点击激活STED，使用635 nm激光并在640–750 nm光谱检测范围内，开始采集包含多个接头皱褶区域的图像。
注意： 在图像采集过程中需密切关注饱和查找表，点击快速LUT按钮以避免过曝（灰度值 >255；8位图像）。

7. 使用相同的设置采集每个实验组的图像：图像尺寸为 2048 × 2048 像素（38.75 × 38.75 μm），采样速率为 400 Hz。
注意： 耗尽激光（STED）功率设置为 65%。

8. 保存图像时，文件名应包含载玻片的代码。
注意： 可以单击“优化XY格式：设置格式”以获得STED成像的最佳采集设置。

9. 更换至下一个编码载玻片，并重复步骤 3.2.3-3.2.8。对所有载玻片重复此操作。

10. STED 显微镜实验结束后，将图像文件传输到另一台计算机，并将原始文件（.lif）保存至外置硬盘或服务器中。

11. 关闭显微镜软件，用镜头纸清洁物镜，然后关闭系统。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
缓冲液与试剂
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (F488)	Life Technologies, Thermofisher	A-11001
Alexa Fluor 488 α-银环蛇毒素 (F488-a-BTX)	Life Technologies, Thermofisher	B13422
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG (F594)	Life Technologies, Thermofisher	A-11032
ATTO-633 α-银环蛇毒素 (F633-a-BTX)	Alomone Labs	B-100-FR
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma	A2153
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech	00-4959-52
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Gibco, Invitrogen	14190-169
无水乙醇	VWR	20821.296
吐温 X-100	Sigma	T8787
浸油，n = 1.518	THORLABS	MOIL-10LF	低自发荧光
神经丝蛋白 (NF-M) 抗体	DSHB	AB_531793
多聚甲醛 (PFA)	MERCK	1.04005
突触小泡糖蛋白 2 (SV2) 抗体	DSHB	AB_2315387
材料
铝镍钴圆柱形磁铁	Farnell France	E822	直径 19.1 mm，最大拉力 1.9 Kg
63倍 1.4 NA 油镜 HCX Plan Apo CS 物镜	Leica Microsystems
100倍 1.4 NA HC PL APPO CS2 物镜	Zeiss
精细锯齿镊	Euronexia	P-95-AA
弯曲细镊 — Moria 虹膜镊	Fine Science Tools	11370-31
超薄剪刀 — Vannas-Tübingen 弹簧剪	Fine Science Tools	15-003-08
加样枪头（圆头，1–200 μL）	COSTAR	4853
Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8	Leica Microsystems
Leica 激光共聚焦显微镜 TCS SP8 Gated STED775 nm	Leica Microsystems
镜头清洁纸	Whatman (GE Healthcare)	2105-841
Superfrost plus 载玻片	Thermo Scientific	J1800AMNZ
中等锯齿镊	Euronexia	P-95-AB
显微镜盖玻片 24×50 mm，No 1.5H，170±5 µm	Marienfield	107222	高精度
Nunclon delta 表面（12孔板）	Thermo Scientific	150628
Nunclon delta 表面（24孔板）	Thermo Scientific	142475
软件
GraphPad	Prism, San Diego (US)	Release N°6.07	统计分析软件
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	Release N° 1.53f
Leica Application Suite X 软件	Leica Microsystems	Release N°3.7.2.2283	免费显微镜软件，可从 https://www.leicamicrosystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ 获取