利用荧光大体显微镜在小鼠脑内进行脑脊液运输的活体成像

摘要

来源：Sweeney, A. M., 等。利用荧光宏观成像技术对完整小鼠颅骨内脑脊液运输进行活体成像。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用荧光成像技术在小鼠大脑中可视化脑脊液（CSF）流动的过程。将荧光示踪剂注射至小脑延髓池（CM），使其随脑脊液在蛛网膜下腔和血管周围间隙中移动，从而实现追踪。通过延时成像记录示踪剂的运行路径，突出显示其经由小动脉进入脑组织的分布情况。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 准备小脑延髓池插管、头骨固定板和头部固定装置

1. 手术前对所有外科器械和头板进行灭菌。
   注意： 荧光示踪剂通过小脑延髓池插管直接注入脑脊液（CSF）中。
2. 简而言之，使用持针器将一根30G × 12.7 mm（½英寸）针头的尖端从约¾处折断，将针头的钝端插入一段长约45 cm的聚乙烯10（PE10）导管一端，确保仅有斜面部分从PE10导管边缘伸出。
3. 将另一根30G针头的斜面端¼处折断，将剩余部分的钝端插入PE10导管的另一端，此时塑料鲁尔锁接头仍保持连接。
4. 用100 µL玻璃注射器吸取无菌人工脑脊液（aCSF：126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH₂PO₄、2 mM MgSO₄、2 mM CaCl₂、10 mM葡萄糖和26 mM NaHCO₃）。
5. 将注射器连接至导管末端，并用aCSF充满导管直至斜面针头尖端。务必确保注射器内完全填充aCSF而非空气，因为空气柱可能导致灌注体积不稳定。
6. 对于慢性实验，保持导管内充满aCSF，并跳过步骤1.7。
7. 对于急性实验，将注射器安装在灌注泵上，回抽约5 mm空气以防止混合；随后回抽实验所需总量的示踪剂（建议额外多取20%以补偿死腔损失）。
   注意： PE10导管应足够长，以确保在加载示踪剂时气泡不会进入玻璃注射器的塑料套管内。在典型实验中，本方案使用10 µL牛血清白蛋白与Alexa Fluor 647偶联物（BSA-647）溶于aCSF中，浓度为0.5%。
8. 确认头板能适配头固定装置，并且尺寸适合所用小鼠。用于判断的解剖学标志包括：窗口上缘与两眼间连线对齐，后缘位于枕嵴前方。
   注意： 不锈钢头板可灭菌后重复使用。大多数氰基丙烯酸盐混合物可用丙酮溶液清除。

2. 手术步骤

1. 称重并麻醉小鼠（例如，使用氯胺酮/甲苯噻嗪；氯胺酮100 mg/kg，甲苯噻嗪10 mg/kg；腹腔注射）。
2. 当小鼠对脚趾夹捏不再有反应时，用无菌水润湿其颈部和头部，并使用电推剪剃毛。剃毛完成后，再次用酒精棉片擦拭该区域，以清除残留的毛发。
   注意：在剪毛前润湿毛发可显著减少切口后成像窗口中的毛发残留量。
3. 将小鼠置于立体定位仪上，放置于温度控制垫上，并在小鼠眼部涂抹凡士林眼膏，以防止眼睛干燥。
4. 用氯己定棉片清洁暴露的皮肤。2分钟后，用酒精棉片擦去氯己定。最后，涂抹碘溶液并使其自然风干。
5. 在颅骨顶部和颈部皮下注射镇痛剂（0.25%盐酸布比卡因）。
6. 从覆盖枕骨嵴的颈部区域开始，沿中线切开表层皮肤，并向前延伸至眶间线。向侧方切开至颞肌插入颅骨的边界处。移除梭形切口范围内的全部皮肤，以暴露额骨和顶骨。
   注意：眶后静脉窦位于眼球后方，耳廓前方存在后颜面静脉的较大分支。切开时需小心，避免损伤这些结构。若发生出血，用无菌棉签压迫止血数分钟，然后继续操作。
7. 用无菌生理盐水冲洗颅骨，并用棉签清洁表面，确保无碎屑和毛发残留，因为这些物质会影响成像质量。为最大限度保持颅骨透明性，应保留骨膜及其上方的筋膜完整。
   注意：若这些结构被意外去除，颅骨可能随时间推移变得干燥且不透明。此时可重新用人工脑脊液（aCSF）润湿，或在急性实验中使用石蜡油与甘油混合物以降低颅骨反射率。
8. 继续进行小脑延髓池插管操作。
9. 插入小脑延髓池（CM）导管后，在头固定板腹侧边缘周围涂抹牙科水泥与氰基丙烯酸酯胶的混合物，并将头固定板置于颅骨上，使头固定板前缘与鼻骨后端对齐，后缘与顶间骨前部对齐，同时确保矢状缝（中线）相对于成像窗口居中且平直（图1B）。
10. 使用数滴胶水加速剂固定头固定板位置。用水泥混合物填充剩余缝隙，并用加速剂固化。
    注意：确保氰基丙烯酸酯胶不接触小鼠眼睛，也不堵塞成像窗口。
11. 将CM导管用胶固定于头固定板，以防止在运输或小鼠苏醒过程中发生脱落。
12. 对于急性实验，跳至步骤2.16。
13. 对于慢性实验，在暴露的颅骨上涂抹一层透明干燥的氰基丙烯酸酯胶，注意避免产生气泡，因为气泡会影响成像效果。该胶层可保护颅骨，且不会干扰成像。确保胶层完全覆盖暴露的颅骨，直至切口边缘的皮肤。
14. 使用止血钳夹住距CM约2–3 cm、充满aCSF的PE10导管，用高温电灼笔切断导管。分离后，压平熔化的PE10导管以封闭导管口。
    注意：在导管完全封闭前不得松开止血钳，并确认导管无泄漏，以防止脑脊液瘘形成。
15. 给予卡洛芬（5 mg/kg，每24小时一次，连续3天；腹腔[i.p.]或皮下[s.c.]注射），并将小鼠放回温度控制的单笼饲养环境中，在成像前至少恢复24小时。在小鼠恢复足够意识以维持胸卧位前，不得离开无人看护。完整的颅窗可保持数周稳定。
    注意：部分术后并发症包括头颅血肿/皮下血肿、脑脊液瘘和感染。
16. 对于急性实验，将小鼠通过头固定板安装至头部固定装置，使颅骨处于固定位置。务必检查麻醉深度，并在小鼠身下放置加热垫。此时小鼠已准备好转移至宏观成像系统。
    注意：需小心将小鼠连同输液泵一同置于推车上进行转移。若CM插管发生移位，将导致颅内压下降，任何脑脊液泄漏均会影响实验结果。

3. 准备小鼠以进行成像

注意：该方案根据成像实验是在麻醉（从步骤 3.1 开始）还是清醒（从步骤 3.2 开始）的小鼠上进行而有所不同。

1. 麻醉小鼠
   1. 将头部固定器放置在宏观成像系统的载物台上，确保从注射泵到脑池（CM）导管的连接管路无扭曲或受力过紧，以免影响示踪剂的灌注。
   2. 观察小鼠的呼吸频率以及黏膜是否呈粉红色，以判断其氧合状态良好。必要时皮下注射生理盐水以维持水合水平。检查动物是否处于充分麻醉状态，若需要可追加麻醉剂量。
   3. 打开宏观成像系统的相机和发光二极管（LED）光源，并启动实时成像（LIVE）模式。
   4. 确认成像视野的放大倍数，使得视野顶部可见鼻额缝、底部可见人字缝，矢状缝平行且居中于图像中央（图1C）。位置调好后，用胶带将头部固定器牢固固定在宏观成像系统载物台上。
   5. 将宏观成像系统对焦于暴露的颅骨表面。尽管宏观成像系统具有相对较大的景深，但小鼠颅骨的曲率仅允许特定区域清晰对焦。最佳成像效果通常出现在冠状缝后方顶骨外侧区域。
      注意：该位置对应大脑中动脉（MCA）的走行区域，也是脑脊液（CSF）主要流入的部位（图1D, E）。
2. 清醒小鼠
   1. 在成像实验前，让动物从头固定板手术中至少恢复24小时；建议更长的恢复期（5–7天）。在此期间，每天训练小鼠在限制管中头部固定0.5–1小时，持续整个恢复期。
      注意：适应性训练可使小鼠在无麻醉状态下连接头部固定器，从而减少正式实验过程中的应激与焦虑。若无法实现清醒固定，且麻醉不影响实验目的，可使用吸入麻醉剂（如异氟烷，2%浓度，氧气流速1–2 L/min）进行短时诱导麻醉，以便快速将小鼠固定于成像平台。
   2. 小鼠固定于头部固定器并置于限制管中后，按步骤3.1.1–3.1.5操作。

4. 荧光脑脊液示踪剂的灌注

1. 急性小脑延髓池插管
   1. 由于示踪剂已在步骤1.6中插入小脑延髓池前装入插管，此时将输注泵设定至所需的流速和体积。常规使用的输注方案为5–10 µL，流速为1–2 µL/min，但这些参数可根据具体实验需求或动物的大小与年龄进行调整。
2. 慢性小脑延髓池插管
   1. 在开始成像实验前，按照急性实验的步骤1.2–1.7准备输注管路，以确保示踪剂可顺利输注。
   2. 管路准备完成后，使用止血钳夹住慢性小脑延髓池插管的封闭端并将其剪开。取步骤4.2.1中准备好的管路针头，轻轻插入插管中。松开止血钳，通过注射泵以实验所需的输注速率（例如2 µL/min）推进脑脊液示踪剂，直至示踪剂到达小脑延髓池内的植入针头。
      注意：若连接管路时针头刺穿管壁，应立即取出针头，剪除被刺穿的部分，并重复此步骤。PE10管路中任何撕裂均会导致泄漏，从而影响实验结果。

5. 设置成像实验

1. 根据所灌注的荧光示踪剂，确定每个通道的激发波长和曝光时间。选择能够观察到示踪剂所需的最短曝光时间，以最大化延时成像的时间分辨率。此曝光时间将用于后续所有旨在比较不同动物之间脑脊液（CSF）转运的实验。
   注意：一种方法是使用CM通路中的示踪剂来调整曝光时间。尽管这是一种有用的初步方法，但仍需在后续实验中逐步优化。
2. 设定实验持续时间以及图像采集的时间间隔。实验通常持续30至60分钟，具体时长取决于所关注的类淋巴系统转运阶段。对于大多数实验，每分钟1帧或更快的帧率已足够。
3. 设置文件名和保存路径。
4. 如果在采集成像数据的同时还需同步记录其他变量（例如心电图、动脉血压、电生理信号），可对宏观成像系统和泵进行编程，使其由数据采集软件触发。在进入下一步之前，请确认宏观成像系统的触发功能正常。

6. 经颅光学成像实验

1. 同时开始示踪剂输注和成像。
2. 定期检查小脑延髓池（CM）导管和PE10管路是否有泄漏迹象。如果在CM处出现示踪剂泄漏，则该实验结果必须排除。
   注意：如果示踪剂开始在小脑积聚，而未沿大脑中动脉（MCA）的类淋巴通路运行，则很可能CM导管误插入小脑。此类数据不应纳入分析。
3. 对于急性实验，在完成实验后，将小鼠从显微镜下取出，并确认其仍处于充分麻醉状态。迅速将小鼠断头并取出脑组织，将脑组织在4%多聚甲醛（PFA）中于4 °C下浸没固定过夜。
   1. 对于慢性实验，在成像完成后，从小鼠体内移除CM导管中的导管线，用无菌aCSF冲洗，并使用高温电灼头封闭CM导管。将小鼠从头部固定架上取下并放回笼中。重复此过程直至不再需要进一步成像，然后执行步骤6.3。

结果

图1. 经颅宏观成像。（A）宏观成像系统的示意图。（B）颅骨上头板位置的背侧视图。顶间骨以及鼻骨、额骨和顶骨均清晰可见。（C）成像过程中尚未注入脑脊液示踪剂时暴露的小鼠颅骨，清楚显示完整颅骨的所有颅缝。比例尺：1 mm（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 盐酸布比卡因			罗切斯特大学动物实验中心
100 µL 气密性注射器，型号 1710 TLL，PTFE 鲁尔锁	Hamilton 公司	81020
A-M Systems 牙科水泥粉末	费希尔科技	NC9991371
卡洛芬			罗切斯特大学动物实验中心
氯己定	Prevantics	B10800
CMOS 相机	滨松光子学	ORCA Flash 4.0
头固定板	罗切斯特大学	无目录编号	由罗切斯特大学机械加工车间定制制作
高温电灼器	Bovie 医疗公司	AA01
Insta-set 加速剂	Bob Smith 工业公司	BSI-151
异氟烷 - Fluriso	Vet One	502017	罗切斯特大学动物实验中心
氯胺酮			斯特罗格纪念医院药房
Krazy Glue 胶水	Elmer's 产品公司	无目录编号，参见评论中的链接	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-KG48348MR-Advance-Multicolor/dp/B000BKO6DG
Micropore 外科胶带	费希尔科技	19-027-761
多聚甲醛	Sigma-aldrich	P6148
PE10 - 聚乙烯管，每英尺 0.011" × 0.024"，100 英尺连续长度	Braintree 科学公司	PE10 100 FT
Pump 11 Elite 双注射器输注泵	哈佛仪器公司	70-4501
PURALUBE VET 眼膏	Dechra
Puritan PurSwab 棉签清洁棒	费希尔科技	22-029-553
研究用宏观变焦显微镜	奥林巴斯	MVX10
小鼠用简易头固定板	Narishige 国际美国公司	MAG-1
一次性使用针头，BD 医疗	VWR	BD305106
无菌酒精擦拭垫	费希尔科技	22-363-750
可调 LED 光源	PRIOR Lumen 1600-LED
赛拉嗪			罗切斯特大学动物实验中心