使用三光子荧光显微镜对斑马鱼大脑进行深层组织成像

摘要

来源：Hontani, Y., et al. 完整小鼠与斑马鱼脑中的深层组织三光子荧光显微镜技术. J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了在麻醉斑马鱼大脑中进行三光子成像的设置与操作过程。该方案能够实现对荧光标记神经元的深层组织可视化，揭示神经科学研究中神经元的实时活动与结构。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 斑马鱼大脑的活体成像
   注意：为了在物镜下准确定位斑马鱼的大脑，使用与激发光同一路径的辅助电荷耦合器件（CCD）相机进行宽场成像。
   
   1. 设置显微镜并校准激光功率。
   2. 在显微镜上安装低倍率（通常为4倍）物镜。
   3. 将装有斑马鱼和导管的培养皿置于显微镜下。
   4. 使用发光二极管（LED）光源照亮培养皿。
   5. 打开图像采集软件的相机模式（图1）。
   6. 点击实时。
   7. 在屏幕右侧选择通道A。
   8. 调整直方图设置以清晰显示图像。
      注意：应根据需要随时更新这些设置。
   9. 将电机控制器上的电机设置调整为基座。
   10. 缓慢降低物镜，直到可见斑马鱼。
       注意：确保物镜不与鱼头发生任何物理接触。
   11. 将鱼头中心置于视野中央。
   12. 将物镜向上移动，远离鱼头。
   13. 用高数值孔径（NA）物镜替换低倍率物镜，用于三光子显微成像（3PM）。
       注意：低倍率物镜与高NA物镜无需严格齐焦，但必须足够接近，以确保鱼头位于高NA物镜的视野范围内。
   14. 缓慢降低物镜，确保物镜不与鱼头发生物理接触。在CCD相机软件中，当鱼头顶部可见时停止移动物镜。将z轴位置设为0 μm。
       注意：使用水浸物镜时，确保物镜下方无气泡。
   15. 关闭LED光源，并拉上系统周围的遮光帘。
   16. 将图像采集软件设为多光子GG模式以进行三光子成像，并将物镜下的激光功率设置为低于1 mW（脉冲重复频率约为1 MHz）。
   17. 在电机控制器上将电机设置按钮从基座切换至物镜。
   18. 调暗房间内的灯光。
   19. 打开光电倍增管（PMTs），并开启三光子激发光源的快门。确保在荧光信号通道中因自发荧光、在三次谐波产生（THG）信号通道中因骨骼的THG效应可观察到骨骼轮廓（图1C）。
   20. 通过在更深成像时逐步提高激光功率，实现不同深度的成像。

结果

图1：鱼类活体成像的代表性截图（方案第1部分）。（A）图像采集软件在使用4倍物镜时的相机模式界面。软件中的关键功能已标出并编号如下：1. 图像采集软件的成像模式，可选模式包括相机、多光子和多光子GG。当使用C...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5% 聚维酮碘	Amazon	NDC 67818-155-32	手术区域的无菌清洁
70% 乙醇	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	手术区域的无菌清洁
琼脂糖	Sigma	A4718-256	制备斑马鱼成像腔
Bergamo II	Thorlabs		多光子成像显微镜
布比卡因	Cornell Veterinary Care
GaAsP 放大光电倍增管	Thorlabs	PMT2100	光电倍增管检测器
加热器（800 W）	Finnex		斑马鱼用水的水族箱加热器
Kimwipes 擦拭纸	Kimtech		用于斑马鱼制备的实验室擦拭纸
纳米注射器（10 微米）配 36 G 针头	WPI	NANOFIL + NF36BV	用于注射泮库溴铵的注射器和针头
蠕动泵	Elemental Science	ESI MP2	斑马鱼实验装置用水泵
聚乙烯管（内径 0.58 mm，外径 0.965 mm）	Elemental Science	MP2 泵用管	插入斑马鱼口中的导管
SR400	Stanford Research Systems	SR400	光子计数器
标准光电二极管功率传感器	Thorlabs	S122C	功率检测器
细条状封蜡	Corning Rubber Co., Inc.		固定斑马鱼腔室中的导管
ThorImage	Thorlabs		图像采集软件
三卡因（间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐）	MP	103106	斑马鱼麻醉与安乐死
Tygon 管（内径 1/16 英寸，外径 1/8 英寸）	Tygon		用于斑马鱼制备过程中的水流导管
VaporGuard	VetEquip	931401	用于异氟烷的回收
Vetbond 组织粘合剂	3M	1469SB	将玻璃窗粘附于小鼠颅骨，以及在制备斑马鱼时粘合实验室擦拭纸
XLPLN25XWMP2	Olympus		多光子激发专用物镜