使用三光子荧光显微镜对斑马鱼大脑进行深层组织成像

Abstract

资料来源：Hontani， Y. 等人。完整小鼠和斑马鱼大脑中的深组织三光子荧光显微镜。J. Vis. Exp.（2022年）

该视频演示了在麻醉斑马鱼大脑中设置和执行三光子成像。该协议能够对荧光标记的神经元进行深层组织可视化，揭示神经元活动和结构，用于神经科学研究应用。

Protocol

所有涉及动物模型的程序都经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审查。

1. 斑马鱼大脑中的活体成像
   注意：为了在物镜下方正确定位鱼脑，在与激发光相同的路径上使用辅助电荷耦合器件（CCD）相机进行宽场成像。
   
   1. 设置显微镜并校准功率。
   2. 将低放大倍率（通常为 4 倍）物镜放在显微镜上。
   将
   3. 装有鱼和管子的培养皿放在显微镜下。
   4. 使用发光二极管 （LED） 光源照亮培养皿。
   5. 打开图像采集软件的相机模式（图1）。
   6. 点击直播。
   7. 选择屏幕右侧的频道 A。
   8. 调整直方图设置以清楚地看到图像。
      注意：这些需要根据需要进行更新。
   9. 将电机控制器上的电机设置设置为 Base。
   10. 降低物镜，直到鱼可见。
       注意：确保物镜不会与头部进行任何物理接触。
   将
   11. 鱼头的中心放在视野的中心。
   将
   12. 目标向上移动并远离鱼头。
   将
   13. 低倍率物镜更换为高数值孔径 （NA） 物镜，用于 3PM（三光子显微镜）。
       注意：低倍率镜头和高 NA 物镜不需要齐焦，但必须足够近以确保鱼在高 NA 物镜的视野内。
   14. 慢慢降低物镜，确保物镜不会与头部发生任何物理接触。在CCD相机软件中，当头顶可见时停止移动物镜。将 z 位置设置为 0 μm.
       注意：使用水浸物镜时，确保物镜下方没有气泡。
   15. 关闭 LED 光源并关闭系统周围的深色窗帘。
   将
   16. 成像采集软件设置为多光子 GG 模式以进行 3P 成像，并将物镜下的功率设置为小于 1 mW（脉冲重复率为 ~1 MHz）。
   将
   17. 电机控制器上的电机设置按钮从"基本"更改为"目标"。
   关
   18. 掉房间里的灯。
   打开
   19. 光电倍增管 （PMT） 并打开 3PM 激励源快门。确保由于自发荧光而出现在荧光信号通道中，由于骨骼的THG而出现在三次谐波产生（THG）信号通道中（图1C）。
   通过
   20. 在更深的成像时增加功率水平，在不同深度进行成像。

Results

图 1：鱼活体成像的代表性屏幕截图（协议第 1 节）。（一个） 图像采集软件的相机模式视图，配备 4 倍物镜。该软件的主要功能概述和编号如下： 1. 图像采集软件的成像模式。模式选项包括 相机（Camera）、多光子（Multiphoton） 和多光子 GG。对于使用 CCD 相机进行白光成像，选择相机模式。2...

Materials