利用延时扫描共聚焦显微镜成像胶质母细胞瘤组织中的肿瘤细胞迁移

摘要

来源：Parker, J. J., et al. 一种用于研究肿瘤细胞迁移及抗侵袭药物个体化效应的人源胶质母细胞瘤类器官切片培养模型。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过共聚焦显微镜对表达绿色荧光蛋白（GFP）的胶质母细胞瘤组织切片进行成像。以恒定的时间间隔采集高分辨率图像，以追踪肿瘤细胞的运动及迁移方向。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

1. 肿瘤细胞标记 通过表达绿色荧光蛋白的逆转录病毒

注意：用于分析肿瘤细胞迁移的延时显微成像需要对脑片培养中的细胞进行稳定且长期的荧光标记。建议使用逆转录病毒，因为它可选择性地感染分裂中的细胞，从而在肿瘤细胞群体中富集荧光标记，而非小胶质细胞或脑片中存在的其他细胞类型。标准化的感染条件表明，病毒滴度为 10⁴ CFUs/µL 时，可实现足够的绿色荧光蛋白表达，以用于细胞迁移的追踪与分析。提高病毒滴度、使用非选择性病毒（i.e. 腺病毒、慢病毒）或其他对所有细胞进行标记的方法可能在细胞迁移过程中阻碍清晰细胞边界的识别，从而增加分析难度。可根据需要选用并优化其他荧光标记物。

1. 获取用于肿瘤切片感染的逆转录病毒，可通过以下方式 通过 标准方案5,14或来自商业来源。通过将适当体积的病毒上清液加入无补充剂的神经元培养基中，稀释至病毒滴度为10⁴ 菌落形成单位（CFUs）/µL
2. 培养7至10天后，用5至10 µL病毒（10⁴ CFUs/µL）。将病毒液轻柔地逐滴加至每片组织切片表面。若切片在插入物表面漂浮，可减少上清液的添加量。将含有组织切片培养物的培养板放回培养箱中。
3. 从病毒感染后24小时开始评估切片中标记的肿瘤细胞。这一时间间隔可能因病毒整合及荧光基因表达动力学的不同而有所变化。对于本实验所使用的病毒载体，需72小时才能在标准落射荧光显微镜下观察到明显的荧光信号。​
   注意： 极少数情况下，切片中病毒标记的细胞主要分布在周边区域，这可能会给共聚焦成像带来困难。为避免这一问题，应尽量减少切片的厚度及其厚度在切片范围内的不均匀性。若组织切片培养物在中央区域过厚，可能会影响营养物质的充分渗透，从而限制活跃分裂的肿瘤细胞群体的生长。一种用于筛查该问题的定性检测方法是加入四唑盐染料试剂（即 将 MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）加入脑片培养基中。加入试剂后未变为蓝色的区域表明缺乏代谢活性，提示脑片健康状态受损。

2. 肿瘤细胞迁移的延时单光子激光扫描共聚焦成像

注意：在确认转导成功且细胞培养状态良好后，可先在对照条件下进行成像，随后在处理条件下进行相同时长的成像。采用本方案，细胞在每种条件下均成功实现了长达12小时的成像与追踪。然而，更短或更长的成像时间及环境干预也可能提供有价值的信息。

1. 显微镜载样
   1. 成像前，向玻璃底培养皿中加入 1 mL 新鲜切片培养基。
   2. 将玻璃底培养皿中的培养基置于培养箱中平衡 15 分钟。
      ​注意：此时可在切片培养基中加入可溶性标记试剂，例如荧光标记的凝集素（i.e. 用于小胶质细胞标记的 Isolectin IB4）或配体偶联的量子点，以便在成像过程中识别特定细胞亚群。
   3. 在超净工作台中使用无菌镊子将待成像的插入式培养小室转移至玻璃底培养皿中，并将培养皿运送至显微镜载物台上。
   4. 将脑片培养物置于密封的显微镜载物台培养箱中，维持 37 °C 和 5% CO₂ 的环境。若条件允许，使用无菌 H₂O 对培养腔进行加湿，以防止培养基过度蒸发（对于长时间成像实验尤为重要）。
   5. 使用共聚焦显微镜，配备长工作距离的 10X 干镜物镜，并支持单光子和/或多光子激光激发。​注意：确保显微镜物镜具备足够的工作距离。由于载物台培养箱、玻璃底培养皿和组织培养插入小室增加了整体高度，因此必须使用长工作距离的物镜。
   6. 固定玻璃底培养板，移除塑料培养皿盖，并覆盖一层透气膜。
2. 图像采集
   1. 使用显微镜观察脑片，选择切片边缘与中心之间荧光标记肿瘤细胞密度适中的视野进行成像。避免在切片边缘区域成像，因为该区域在成像过程中更容易发生组织位移。可使用脑片固定栅（tissue slice harps）以减少位移。
   2. 使用成像软件的多维分析模式设定 Z 轴堆栈的起始（底部）和终止（顶部）边界，确保所有成像位置均包含可见的荧光细胞信号。对切片中 150 - 200 µm 的深度进行成像，Z 轴步进恒定为 10 µm，可为追踪细胞迁移路径提供足够的分辨率（可根据具体成像需求进行调整）。
   3. 若显微镜配备电动载物台，需为每次 Z 轴堆栈采集预留充足时间。设定采集时间间隔等于每个位置的扫描时间乘以需成像的位置数量（i.e. 需成像的肿瘤区域）。​
      注意：若需同时激发绿色和红色荧光染料，请使用双激光线扫描程序，同时采用 488 nm 和 633 nm 激发。所选激光激发波长应根据所表达的荧光蛋白种类进行调整。
   4. 在不同肿瘤区域成像时，保持激光功率和共聚焦针孔设置一致。使用能够清晰分辨肿瘤细胞胞体和突起的最低激光功率，以减少光毒性。具体的成像参数单位（i.e. 功率和共聚焦针孔设置）将根据显微镜和激光光源的规格而有所不同。
   5. 为补偿潜在的培养基蒸发影响，可在焦平面逐渐靠近物镜的方向上增加 2 - 3 个“缓冲”Z 轴堆栈步进，从而有效防止组织在垂直方向上超出 Z 轴堆栈的采集范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM 高糖培养基	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A 培养基，不含酚红	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 补充剂 (50X)，无血清	Invitrogen (Gibco)	17504-044
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
GlutaMAX 补充剂	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-谷氨酰胺 (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
制霉菌素悬浮液	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	在 DPBS 中浓度为 10,000 单位/mL，无菌处理，BioReagent，适用于细胞培养
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen (Gibco)	16520-050	熔点为 65.5 °C，在 37 °C 下保持液态，低于 25 °C 时迅速凝固
Griffonia simplicifolia 来源的异凝集素 GS-IB4，Alexa Fluor 647 标记	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	用于培养基中对小胶质细胞/巨噬细胞进行标记
pRetroX-IRES-ZsGreen1 载体	Clonetech	632520
Retro-X 浓缩试剂	Clonetech	31455	用于病毒上清液非超速离心浓缩的结合树脂
pVSG-G 载体	Clonetech	631530	Retro-X 通用逆转录病毒表达系统的一部分
GP2-293 病毒包装细胞	Clonetech	631530	Retro-X 通用逆转录病毒表达系统的一部分
氰基丙烯酸酯胶（瞬间胶）	Sigma-Aldrich	Z105899	中等黏度
Peel-A-Way 包埋模具（方形 - S22）	Polysciences, Inc.	18646A-1	用于肿瘤样本包埋的模具
不锈钢微型刮勺	Fisher Scientific	S50823	将仪器勺头颈部弯曲 45 度
弯曲型 Fisherbrand 解剖细尖镊	Fisher Scientific	08-875
单刃剃须刀片（American Safety Razors）	Fisher Scientific	17-989-001	刀刃厚度为 0.009 英寸。使用前需取下压接的钝边保护盖，再装入振动切片机
Leica VT1000 S 振动切片机	Leica Biosystems	VT1000 S
亲水性 PTFE 细胞培养插件	EMD Millipore	PICM0RG50	直径 30 mm，亲水性 PTFE，孔径 0.4 µm
35 mm 玻底培养皿	MatTek	P35G-1.5-20-C Sleeve	玻璃直径 20 mm，盖玻片玻璃厚度 1.5
LSM 510 共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 510	10x 空气物镜 (c-Apochromat NA 0.45)
PECON 显微镜载物台培养箱	PeCON Germany	(已停产)	Incubator PM 2000 RBT 是一款可替代产品，专为 Zeiss 显微镜设计